蜜炙款冬花质量标准研究

颜 爽，何宇新，毛正睿，付 帅

(西华大学食品与生物工程学院， 四川 成都 610039)

款冬花为菊科植物款冬的干燥花蕾。蜜炙是中国传统炮制方法之一，蜂蜜[1]本身作为一种中药，据《本草纲目》记载：“其入药之功有五：“清热也，补中也，解毒也，润燥也，止痛也。生则性凉，故能清热；熟则性温，故能补中。甘而和平，故能解毒；柔而濡泽，故能润燥。缓可以去急，故能止心腹、肌肉、疮疡之痛；和可以致中，故能调和百药，而与甘草同功”。但在炮制过程中，蜂蜜常以辅料的形式与药物共制，用蜂蜜炮制款冬花，能够增强款冬花止咳化痰、润肺下气的疗效，起到协同作用[2]。越来越多的中药材以其炮制品的形式入药，中药炮制品的使用越来越普及化，但《中国药典》对蜜炙款冬花的质量标准并未详细规定，在临床使用中没有专门针对炮制品制定的质量标准可以参考，使得炮制品的使用没有具体的规定；因此，本研究参考2015年版《中国药典》款冬花项下的质量标准，建立蜜炙款冬花质量标准，为中药炮制品质量规范化研究奠定基础，同时为蜜炙款冬花的使用提供参考标准。

1 仪器与材料

1.1 仪器

普通光学显微镜(上海尼康仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司)；BT423s电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；BT25s十万分之一天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；电热恒温隔水式培养箱(湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司)；数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村有限公司)；Waters e2695-2424高效液相色谱(上海沃特世科技有限公司)。

1.2 材料

蜜炙款冬花(批号：171201、171202、171203、171204、171205、171206)，购自四川省中药材饮片厂；款冬酮对照品，购自上海源叶生物科技有限公司，供含量测定用，HPLC≥98%，批号104012-37-5；甲醇：色谱纯，TEDIA；乙醇、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、丙酮等为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。

2 实验方法及结果与分析

2.1 薄层色谱法鉴别

2.1.1 样品液制备

取蜜炙款冬花粉末1 g，加入乙醇20 mL，超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。另取款冬花对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取款冬酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 薄层色谱定性鉴别实验方法

照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各2～5 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，再以同一展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。

2.1.3 薄层色谱法定性鉴别结果

实验结果如图1所示，在薄层板色谱上，供试品薄层色谱在对照药材薄层色谱与对照品薄层色谱相应的位置显示相同颜色的斑点。

注：1～6为蜜炙款冬花；7为款冬酮对照品。

2.2 蜜炙款冬花的水分测定

照2015版《中国药典》四部通则0832第二法(烘干法)进行蜜炙款冬花的水分测定。将扁形称量瓶洗净，干燥至恒重，然后精密称定各批次的蜜炙款冬花约10 g，平铺于扁形称量瓶中，厚度在5 mm左右，共计6份。记录装有蜜炙款冬花的称量瓶的总重量后，打开扁形称量瓶盖，置于电热恒温鼓风干燥箱中，温度设置为105 ℃，干燥5 h后拿出。将扁形称量瓶瓶盖盖好后置于普通干燥器中冷却30 min后，精密称定并记录此时装有蜜炙款冬花的扁形称量瓶的重量。再将装有蜜炙款冬花的扁形称量瓶放入设置为105 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥1 h，在普通干燥箱中冷却后再称重，直到连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量计算供试品中的含水量。

6批蜜炙款冬花水分测定结果如表1所示。

结果显示，6批蜜炙款冬花含水量为10.290%～12.778%，平均含水量为11.633%，取其120%为13.960%，结合实际情况，暂将蜜炙款冬花含水量要求定为：不得超过14%。

表1 蜜炙款冬花水分测定结果

2.3 蜜炙款冬花的总灰分测定

2.3.1 灰分测定方法

照2015版《中国药典》四部通则2302总灰分测定法对蜜炙款冬花总灰分进行测定，结果如表2所示。将6个坩埚洗净后灼热至恒重，取各批次的蜜炙款冬花粉末约3g，置于坩埚中，共计6份。记录好装有蜜炙款冬花的坩埚的总重量后，将6个坩埚缓缓炽热，加热期间要避免燃烧，等到完全炭化时，逐渐升高温度至500～600 ℃，使其完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量(%)。

2.3.2 灰分测定结果

6批蜜炙款冬花总灰分测定结果如表2所示。

表2 蜜炙款冬花总灰分测定结果

测定结果表明，6批蜜炙款冬花总灰分平均值为12.086%，取其120%为14.503%，结合实际情况，暂定蜜炙款冬花总灰分不得超过14%。

2.4 蜜炙款冬花的醇溶性浸出物测定

2.4.1 醇溶性浸出物实验方法

照醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定。分别精密称定各批次的蜜炙款冬花约10 g，置于250 mL具塞锥形瓶中，共6份。分别精密加入100 mL的95%乙醇，盖上瓶塞，记录装有蜜炙款冬花和乙醇的锥形瓶总重量。静置1 h后，连接冷凝回流管并置于水浴锅中保持微沸，1 h后，放冷，取下锥形瓶，盖好瓶塞后称定重量，并用95%的乙醇补足减失的重量。摇匀后过滤，收取滤液，精密量取25 mL滤液置于干燥至恒重的蒸发皿中，并在水浴锅上蒸干。将蒸干后的蒸发皿放入105 ℃的烘箱中干燥3 h后，放入干燥箱中冷却30 min，迅速精密称定质量，并以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2.4.2 醇溶性浸出物实验结果

6批蜜炙款冬花样品按上述方法测定醇溶性浸出物，结果如表3所示。

表3 蜜炙款冬花浸出物测定结果

热浸法测定结果显示，6批蜜炙款冬花醇溶性浸出物含量在22.001%～23.998%范围内，平均值为22.991%，取其80%为18.393%，根据实际测定情况，暂将蜜炙款冬花醇溶性浸出物要求定为：不得低于19%。

2.5 款冬酮含量测定

2.5.1 供试品溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取款冬酮对照品1 mg，置于10 mL容量瓶，加流动相定容至10 mL。制成每lmL含100 μg款冬酮的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取蜜炙款冬花粉末(过四号筛)各1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇20 mL，称定质量，超声处理1 h，放冷，用95%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

阴性对照溶液的配制：取乙醇适量，加水配制成95%乙醇溶液，即得。

2.5.2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇 ∶水(85 ∶15)为流动相；检测波长为220 nm。理论板数按款冬酮峰计算应不低于5 000。

2.5.3 阴性对照试验

取阴性对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图2所示。结果表明在该色谱条件下，阴性对照溶液对样品测定无干扰。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 标准曲线的建立

精密吸取款冬酮对照品溶液2、4、6、8、10 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见表4所示。

图2 阴性对照溶液HPLC色谱图

进样体积/μL进样量/μg峰面积/(μv·s)20.101 4261 37640.202 8524 38160.304 2805 26780.405 61 084 287100.507 01 351 575

以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，得回归方程y=3×106x-16714，r2=0.999 9。

图3 款冬酮含量测定标准曲线

结果表明，款冬酮的进样量在 0.1014～0.5070 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5.4.2 精密度试验

精密吸取款冬酮标准品溶液10 μL，连续进样 6次，记录峰面积，结果如表5所示，并计算RSD值。

表5 精密度试验结果

平均峰面积约为1 346 854，RSD值为0.32%，表明仪器精密度良好。

2.5.4.3 稳定性试验

取同一份蜜炙款冬花供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样10 μL，记录峰面积，结果如表6所示，并计算RSD值。

表6 稳定性试验结果

款冬酮平均峰面积为2 892 294，RSD值为0.43%。表明供试品溶液在12 h内稳定，可满足测定需要。

2.5.4.4 重复性试验

取同一批蜜炙款冬花供试品溶液各6份，分别按照“2.5.1”项下供试品溶液的配制方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，计算款冬酮含量及RSD值，结果如表7所示。

表7 重复性试验结果

平均含量约为0.2143%，RSD值为1.68%。表明方法的重复性良好。

2.5.4.5 加样回收率试验

精密取已知含量的同一批蜜炙款冬花供试品溶液(含量为0.147%)6 份各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入对照品溶液(款冬酮0.050 7 mg/mL)1 mL，精密加入95%乙醇19 mL，称定重量，超1 h，放冷，用95%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录数据，计算平均加样回收率和RSD值，结果如表8所示。

回收率在98.48%～101.82%之间，平均回收率约为99.92%，RSD为1.23%。表明该方法准确度良好。

2.5.5 供试品测定

按照“2.5.1”项下配制对照品溶液及供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、6批蜜炙款冬花供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定，积分，记录峰面积，对照品溶液色谱图如图4所示，供试品溶液色谱图如图5所示，含量计算结果如表9所示。

含量测定结果表明，6批蜜炙款冬花中款冬酮含量测定的平均值为0.1500%，取其80%为0.1200%，根据实际测定结果，暂定蜜炙款冬花中，按干燥品计算，含款冬酮(C23H34O5)不得少于0.12%。

表8 加样回收试验结果

图4 款冬酮对照品溶液HPLC色谱图

图5 蜜炙款冬花供试品溶液HPLC色谱图

批号样品取样量/g款冬酮含量/%平均含量/%1712011712021712031712041712051712061.0231.0061.0111.0321.0541.0040.154 40.151 10.145 60.149 10.155 30.144 50.150 0

2.5.6 蜜炙前后款冬酮含量对比

将6批生品款冬花在蜜炙前后分别进行款冬酮含量测定，测定结果如表10所示。

表10 款冬花蜜炙前后款冬酮含量对比

经过本研究验证发现,蜜炙后的款冬花中特有成分款冬酮的含量确实高于蜜炙前，款冬酮作为款冬花发挥润肺止咳功效的重要成分，蜜炙后款冬酮含量的增大则进一步验证了蜜炙对中药材更好地发挥药效起到不容忽视的作用，从而体现了本研究的必要性和可行性。

3 讨论

通过本研究实验结果分析，现拟定蜜炙款冬花的质量标准如下：在薄层板色谱上，供试品薄层色谱在对照药材薄层色谱与对照品薄层色谱相应的位置显示相同颜色的斑点；水分不得超过14%，总灰分不得超过14%，醇溶性浸出物不得少于19%；含量测定中供试品按干燥品计算，款冬酮(C23H34O5)含量不得低于0.12%。

款冬酮作为款冬花中特有的物质，对款冬花以及款冬花相关炮制品质量控制具有重要意义。相关研究[3]发现蜜炙后的款冬花中款冬酮的含量明显高于蜜炙前[4]。药理研究表明，蜜炙后的款冬花其润肺止咳的功效增强，而款冬酮[5]则对血小板活化因子[6]引起的血小板聚集有明显的抑制作用。血小板活化因子作为炎症、气喘相关的脂类介质，款冬酮对其的抑制作用体现了这一特有物质在款冬花润肺止咳功效中的重要地位。蜜炙后的款冬花中款冬酮含量的增加与蜜炙款冬花在润肺止咳药效上的增强之间的药理联系，还有待进一步的研究。