UPLC-MS/MS测定蜂王浆中7种磺胺类药物的残留

王 伟，尤翠萍

(1.临沂市食品药品检验检测中心， 山东 临沂 276000； 2.临沂市人民医院， 山东 临沂 276000)

蜂王浆是众多蜂产品中的一种，含有12种以上蛋白质、26种以上氨基酸、10多种维生素，其中B族维生素含量特别丰富，相较于其他蜂产品，蜂王浆中的10-羟基-癸烯酸(10-HDA)是其所特有的活性物质。其性平，味甘、酸，入脾、肝、肾经，为中国传统补益用药。蜂王浆营养价值高无毒副作用，能够提高免疫力，抗氧化、抗菌消炎等[1-5]。蜜蜂养殖中，为了防治疾病，抗生素经常被用到。磺胺类药物是广谱抑菌药，对细菌性病害效果较好，价格较低，在蜜蜂养殖中常用于防治疾病，增加蜂蜜产量[6-7]。现国家标准已经明确规定磺胺类药物的残留限量，如在养殖中滥用，且不遵守休药期规定，会导致蜂产品如蜂蜜、蜂王浆中磺胺类药物残留超过限量，严重影响产品质量。

目前蜂产品中磺胺类药物的主要检测方法为高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等[8-10]，其中蜂王浆中磺胺类药物残留最常见的检测方法为高效液相色谱法[11-13]。高效液相法中前处理过程复杂，甚至还需要衍生化，且仪器检测所需时间较长，只能通过光谱和出峰时间来判断，液质串联法在定量、定性检测中更为准确，且一次性能够检测组分较为复杂的化合物，逐渐成为一种更好的检测方法。本文中建立了同时能够检测7种磺胺类药物的超高效液相-串联质谱法。该方法灵敏度高，结果准确，前处理简单，相较于其他液质串联法所需时间更短，前处理方法上也进行了优化，适用于蜂王浆中磺胺类药物的快速筛查。

1 材料与方法

1．1 主要仪器

液相色谱-质谱仪，其中液相系统为1290 型，质谱为6470型，均购自Aglient公司；电子天平：PL206型，购自瑞士梅特勒公司。

1.2 主要试剂

磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司；色谱纯甲醇、乙腈购自默克公司；实验用水由Milipore 纯水系统制备。

1.3 液质分析条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL ；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱条件：0～1 min B为5%，1～3 min B为5%～30%，3～4 min B为30%～50%，4～6 min B为50%～100%，6～8 min B为100%，8.1～10 min B为5%。

1.3.2 质谱条件

扫描方式：正离子扫描；监测方式：MRM 多反应监测；喷雾电压：3 500 V ；气流量：8 L/min；气体温度：250 ℃；鞘气温度：300 ℃；鞘气流量：12 L/min。

1.4 标准溶液制备

分别称取 7 种固体标准品20.00 mg置于20 mL容量瓶中，用适量甲醇超声溶解，定容至20 mL，配制成1 mg/mL的混合标准品储备液，-20 ℃保存备用。

1.5 样品前处理

准确称取5.0 g蜂王浆于50 mL离心管中，加入5 mL水溶解，涡旋振荡1 min，使之全部溶解，再加入15 mL乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液，充分涡旋振荡提取15 min，于4 ℃ 5 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，氮气吹干，加入5 mL水涡旋振荡复溶。将该溶液全部转移至已经预先活化好的HLB固相萃取柱，用10 mL水淋洗后，再用5 mL甲醇洗脱，用15 mL离心管收集全部洗脱液，40 ℃加热条件下氮气吹干，最后加入1 mL 乙腈 ∶水(10 ∶90)溶液，涡旋振荡溶解残渣，0.22 μm滤膜过滤后上机检测。

2 结果与讨论

2.1 样品中磺胺类药物的提取

分别用几种不同常见试剂来提取蜂王浆中残留的磺胺类药物，如二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液等，通过比较加标回收的回收率来择优选用，其中用乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液提取效果最好，所得回收率最高。故本实验中用乙腈-水(V乙腈∶V水=80 ∶20)溶液做提取试剂。

2.2 仪器条件优化

首先摸索7种磺胺类药物的最适质谱条件，比较不同裂解电压与碰撞能量对母离子与子离子响应值的影响，选出其中响应值最高的子离子作为定量离子，响应值稍低的作为定性离子，具体参数见表1。

其次优化色谱条件，初次选择乙腈-水为流动相，磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的峰形有较严重拖尾现象，因此在水相中加入了低浓度的甲酸(0.1%)水溶液，峰形得到了较好的改善。设置梯度洗脱程序，逐渐增加有机相比例，能够在 10 min 内完成7种磺胺类药物的分析。具体7种化合物的总离子流(TIC)图如图1所示。

表1 7种磺胺类药物的质谱条件

1─磺胺甲恶唑；2─磺胺甲基嘧啶； 3─磺胺氯哒嗪；4─磺胺二甲嘧啶；5─磺胺二甲氧嘧啶；6─磺胺间甲氧嘧啶；7─磺胺喹恶林。

2.3 标准曲线方程以及检出限、定量限

液质实验中常常受到基质效应的影响，不同的基质会干扰目标化合物的响应值，使信号增强或减弱，会影响方法的定量限、准确度等。因此本文使用空白基质标准曲线，分别称取6份质量为5.0 g蜂王浆，分别加入不同体积的混标溶液，最后配成质量浓度为0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 ng/mL溶液，按上述前处理方法进行测定。以被测组分的质量浓度为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标，作出标准曲线。其中方法检出限 (LOD)为3倍信噪比(S/N)所对应的浓度，定量限 (LOQ)为10倍信噪比(S/N)所对应的浓度。数据处理后所得7个磺胺类药物的对应曲线方程、检出限与定量限见表2。结果表明7种磺胺类药物对应的标准曲线均有良好的线性关系，相关系数(r2)为 0.9955～0.9987，方法检出限为0.5～8.0 μg/kg，定量限为1.0～10.0 μg/kg。

表2 7种磺胺类药物的标准曲线方程及相关系数

化合物名称标准曲线方程相关系数 r2磺胺甲基嘧啶 y=40938.38x-852.420.997 7磺胺氯哒嗪 y=45150.49x-2355.260.997 2磺胺二甲嘧啶 y=49240.36x+412.200.997 7磺胺间甲氧嘧啶 y=33846.96x-745.980.997 2磺胺甲恶唑 y=21317.87x-119.410.998 2磺胺间二甲氧嘧啶y=163807.17x+1919.110.998 7磺胺喹恶啉 y=22198.37x-15.360.995 5

2.4 准确度与精密度

称取5.0 g空白样品，分别加入不同体积100 ng/mL的混标溶液，设置高、中、低3个加标浓度，其中低浓度为1倍检出限，中浓度为2倍检出限，高浓度为5倍检出限。加标后，按上述前处理方法进行处理，设置空白对照，测定7种磺胺类药物的回收率，结果见表3。

表3 7种磺胺类药物的检出限、回收率及相对标准偏差

由表3可知，该方法回收率为79.29%～102.63%，相对标准偏差为 2.5%～8.4%，结果表明该方法的精密度、准确度能够满足检测要求。

2.5 实际样品测定

用上述方法检测了购自超市的10 批蜂王浆，均未检出7种磺胺类药物残留。

3 结论

本文建立了蜂王浆中7种磺胺类药物残留的超高效液相-串联质谱联用方法，检出限为 0.5～8.0 μg/kg。该方法灵敏度高、前处理较简单简便、仪器分析时间较短、结果准确，能够满足基层食品检验检测实验室的日常检测要求，具有较广阔的应用前景。