猴T淋巴细胞趋向性病毒l型RPA和荧光RPA检测方法的建立*

熊 炜 林颖峥 魏晓锋 陈鸿军 张 强 王 艳 李 健

(1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135)(2. 上海实验动物研究中心，上海 201203)(3．中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

猴T淋巴细胞趋向性病毒(Simian T-cell 1ymphotropic virus，STLV)为逆转录病毒，其基因组为单链RNA，它与人T淋巴细胞趋向性病毒(Human T- cell lymphotropic virus，HTLV)同属于灵长类嗜T淋巴细胞病毒，是进出境实验用猴筛查的重要病原之一[1-2]。1982年STLV首次在日本猕猴体内发现，之后在亚洲和非洲超过30种非人灵长类动物中发现了STLV；根据核酸序列和血清学特性，STLV可分为三个亚型，即STLV-1、STLV-2、STLV-3，其中亚洲非人灵长类动物主要感染STLV-1[3-4]。STLV-l主要侵害猴的免疫系统，与恶性淋巴瘤、淋巴组织增生等疾病密切相关；通常猕猴感染STLV-l后，可较长时间不呈现明显临床症状，期间它作为携带者可将病毒传给其它易感猴，对猴的健康造成影响，干扰实验结果[5]。目前报道的STLV-1的检测方法主要有免疫荧光、中和试验、蛋白印迹和ELISA等血清学方法，RT-PCR是STLV-1最常用的核酸检测方法[6-8]。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是一种新型的，可以替代PCR的核酸检测技术，它能够在20 min内进行常温下的单分子核酸检测[9-10]。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。为了提高口岸对进出境野生及实验用灵长类动物STLV-1感染情况的监测和流行病学调查，本研究建立了RPA和荧光RPA检测STLV-1的方法，并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TRIzol购自Invitrogen公司，Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker(DL2000)购自Takara公司；RPA检测试剂购至英国TwistDx Inc公司。

1.2 病毒样品来源及处理

STLV-1阳性组织和血清样为本室保存。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3 000 g离心15 min，收集上清液待检。本研究使用的其他病毒和细菌核酸，如猴D型逆转录病毒(Simian type-D retrovirus，SRV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)、猴B病毒(Simian B virus，BV)、沙门氏菌、志贺氏菌样本，由本室保存。

1.3 RNA抽提及cDNA模板制备

取100 μL待检上清液或血清，加1 mL TRIzol试剂，吹打20次，加入200 μL氯仿，涡旋震荡30 s混匀；12 000 r/min离心15 min；取上层水相，加500 μL异丙醇，颠倒混匀，-20 ℃放置20 min；12 000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀用1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7 500 r/min离心10 min；弃上清，沉淀室温干燥10 min；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4 μL、dNTP 1 μL、随机引物1 μL、RNA酶抑制剂1 μL、AMV逆转录酶2 μL，置PCR仪上42 ℃反应60 min，即得cDNA模板。

1.4 RT-PCR检测

引物针对STLV-1的gag蛋白基因(gag polyprotein)设计，扩增基因片段大小为348 bp，其上游引物为：5‘ GCT CAT CAC TGG CTT AAC TTC CTC C 3’，下游引物为：5‘ ATG TGG ATG CAT GAC TGG AAG GAC 3’。在PCR薄壁管中，加cDNA模板2 μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；最后72 ℃ 3 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍摄。

1.5 RPA引物和探针

使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的STLV-1的gag蛋白(gag polyprotein)基因的保守序列，用Primer Express软件设计RPA引物和探针。RPA正向引物(RPA-STLV1F)序列为5‘ ACA CCG GCT TGG ATC TGT CCC ATT AAC TAC TC 3’， 反向引物(RPA-STLV1R)序列为5‘ CCA TGT GGA TGC ATG ACT GGA AGG ACT TGA GG 3’。 荧光RPA检测的上游引物(RPAY-STLV1F)序列为：5‘ TGC CAA AGA CCT CCA AGA CCT CCT ACA GTA CC 3’，下游引物(RPAY-STLV1R)序列为：5‘ GAC CGG CTA AGG GGT TAT AAC CTG TAA TAC CTC 3’， RPA探针(RPAY-STLV1P)序列为：5’ CTC CCT CCA TCA CCA GCA GCT AGA TAG CCT TA(FAM-dt)(THF)(BHQ1-dt)AGA GGC CGA A-C3 3’。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

1.6 RPA检测

采用GENIE Ⅱ恒温扩增PCR仪。反应体系为：25 μL 2倍反应缓冲液、8.2 μL dNTP、5 μL 10倍基酶混合物、上下游引物(RPA-STLV1F、RPA-STLV1R)各2.4 μL；混匀后，再加入2.5 μL 20倍核心反应液、1 μL 50倍RT反应液；混匀后，最后加入2.5μL 280 mmol/L醋酸镁、1 μL待检核酸溶液。反应条件为：39 ℃孵育20 min。反应结束后，凝胶电泳分析扩增产物，结果判定。

1.7 荧光RPA检测

采用GENIE Ⅱ恒温扩增PCR仪。反应体系为：25 μL 2倍反应缓冲液、7.2 μL dNTP、5 μL 10倍探针酶混合物、上下游引物(RPA-STLV1F、RPA-STLV1R)各2.1 μL、10 μmol/L荧光探针0.6 μL；混匀后，再加入2.5 μL 20倍核心反应液、1 μL 50倍RT反应液、1 μL 50倍Exo反应液；混匀后，最后加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸镁、1 μL待检核酸溶液。反应条件为：39 ℃孵育25 min。反应结束后，查看荧光扩增曲线进行结果判定。

2 结果

2.1 RPA和荧光RPA检测STLV-1的特异性试验

分析STLV-1 gag蛋白基因序列，设计引物及探针，分别建立STLV-1的 RPA和荧光RPA方法，并分别使用猴的其它病毒(如SIV、BV、SRV)作为对照，同时与PCR方法进行对比，确认所建立方法的特异性。结果显示，经RPA、PCR检测，仅有STLV-1阳性样品出现特异性扩增，其它对照病毒样品均呈阴性(图1、图2)；经荧光RPA检测，STLV-1阳性样品在反应15～20 min后荧光信号出现显著增强，而对照病毒样品检测到荧光信号(图3)。

图1 RPA检测STLV-1的特异性注：M:DNA Marker DL2000；1:STLV-1阳性样品1；2:STLV-1阳性样品2；3:SRV；4:SIV；5:沙门氏菌； 6：志贺氏菌；7：空白对照Fig.1 Specificity test of STLV-1 by RPANote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV； 4：SIV；5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

图2 RT-PCR检测STLV-1的特异性注：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1阳性样品1；2：STLV-1阳性样品2；3：SRV；4：SIV；5：沙门氏菌； 6：志贺氏菌；7：空白对照Fig.2 Specificity test of STLV-1 by RT-PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV； 4：SIV； 5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

图3 荧光RPA检测STLV-1的特异性注：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1阳性样品1；2：STLV-1阳性样品2；3：SRV；4：SIV；5：沙门氏菌；6：志贺氏菌；7：空白对照Fig.3 Specificity test of STLV-1 by fluorescent RPANote：M：DNA Marker DL2000；1：STLV-1 positive sample 1；2：STLV-1 positive sample 2；3：SRV；4：SIV；5：Salmonella；6：Shigella；7：Blank control

2.2 RPA和荧光RPA检测STLV-1的敏感性试验

为测试所建立的RPA和荧光RPA方法的敏感性，将STLV-1阳性样品cDNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再分别用建立的两种方法和RT-PCR方法进行检测。结果证实，RPA和荧光RPA方法的检测下限与RT-PCR相同，均为1 pg/μL ～100 fg/μL(图4～图6)。

图4 RPA检测STLV-1的敏感性试验注：M：DNA Marker DL2000；1～8：STLV-1 cDNA模板量分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μLFig.4 Sensitivity test of STLV-1 by RPANote：M：DNA Marker DL2000；1～8：The amount of STLV-1 cDNA was 10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL and 1 fg/μL

图5 RT-PCR检测STLV-1的敏感性试验注：M：DNA Marker DL2000；1～8：STLV-1 cDNA模板量分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μLFig.5 Sensitivity test of STLV-1 by RT-PCRNote：M：DNA Marker DL2000；1～8：The amount of STLV-1 cDNA was10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL and 1 fg/μL

图6 荧光RPA检测STLV-1的敏感性试验注：扩增曲线从左至右分别为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL的STLV-1 cDNA模板Fig.6 Sensitivity test of STLV-1 by fluorescent RPANote：The amplification curve from left to right is the amount of STLV-1 cDNA from 10 ng/μL, 1 ng/μL, 100 pg/μL, 10 pg/μL, 1 pg/μL, 100 fg/μL, 10 fg/μL to 1fg/μL

2.3 RPA和荧光RPA检测STVL-1的可靠性试验

为进一步验证建立核酸检测方法的的可靠性，对将本室保存的经RT-PCR确认的7份STLV-1阳性核酸样本及23份STLV-1阴性猴血清分别用RPA和荧光RPA 进行检测，每份样同一方法重复3次。结果显示，7份阳性核酸样本经上述三种方法检测均得到了阳性结果，而阴性样本均未出现特异性扩增，与实际样本的符合率为100%(图7、图8)。

图7 RPA检测7份不同时期分离的STLV-1阳性样品注：M：DNA Marker DL2000；1～7：7份STLV-1阳性样品；8：空白对照Fig.7 RPA Detection of seven positive samplesof STLV-1 seperated at different timeNote：M：DNA Marker DL2000；1～7：7 positive samples of STLV-1；8：Blank control

图8 荧光RPA检测7份不同时期分离的STLV-1阳性样品注：扩增曲线为7份不同时期分离的STLV-1阳性样品Fig.8 Fluorescent RPA Detection of seven positive samplesof STLV-1 seperated at different timeNote：The amplification curve shows seven positive samples of STLV-1 seperated at different time.

3 讨论

由于猴在形态、生理、生化、代谢等诸多方面与人类非常相似，因而作为理想的实验动物模型被应用于生物医药研究领域。国际上对无特定病原体(SPF)猴的定义主要指体内不含STLV、SIV、SRV、猴B病毒(BV)、沙门氏菌、志贺氏菌等特定病原微生物。由于实验用猴进出口贸易的不断扩大，缩短检疫周期，研发简便、快速、特异、敏感的新型检测方法，对提高猴特定病原体筛查的效率，保证进出境实验用猴的健康和质量具有重要意义。

本研究建立了RPA和荧光RPA快速检测STLV-1的方法，通过将猴其它特定病原体与STLV-1对比检测，证实建立的检测方法具有良好的特异性。经灵敏度试验证实，本研究建立的两种STLV-1核酸检测方法，与传统PCR检测方法一样，均具有很高的敏感性。通过对30份STLV-1阳性核酸样本及阴性猴血清样本的重复检测，证实建立的RPA和荧光RPA，具有PCR方法一样的稳定性和可靠性。但是与PCR方法相比，RPA检测方法的优势在于检测周期极短(仅需20 min)、操作简单(只需将核酸与检测体系混合放于恒温设备中即可，RNA检测不需逆转录过程)、检测设备便携(笔记本大小，一次充电可运行12 h)、结果判定简便直观，适合于现场及野外操作。