经支气管镜针吸活检联合多标志物检测在肺癌病理分型中的应用价值

陈菁，刘旭，杨硕，罗光伟

（武汉市第一医院呼吸内科，武汉 430022）

肺癌在男性恶性肿瘤中位居发病率和死亡率第一位，在女性中其发病率也呈逐年上升趋势［1］。近年来虽然肺癌治疗取得了较大进展，但仍存在早期诊断困难、治疗效果差等问题，仍是病死率最高的肿瘤。世界卫生组织将肺癌分为4种主要病理类型，分别为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌和小细胞癌。前三者通常统称为非小细胞肺癌，占所有肺癌的85%，是威胁肺癌患者生存的主要组织类型，其中又以腺癌和鳞状细胞癌常见。不同类型的肺癌治疗手段差别显著，因此对肺癌进行正确的组织学和分子病理学分型是获得正确治疗的重要前提［2-3］。

经支气管镜针吸活检术 （transbronchial needle aspiration，TBNA） 或支气管内超声引导下的TBNA是一种新型肺癌诊断手段，其对肺癌诊断的敏感度达90%，特异度达100%。与PET-CT相比，TBNA具有更高的敏感度和特异度，已被写入2011年国际肺癌研究协会/美国胸科学会/欧洲呼吸学会的肺癌诊治指南［4］。对TBNA获得的标本一般进行基于形态学的HE染色，判断肿瘤的发生，但进一步判定病理分型则存在诸多限制，如细胞量少、分化程度低等。对肺癌病理组织标本进行分子病理学检测，根据已知公认的分型标志物进行检测，可准确地做出病理分型诊断。研究［5-6］显示，肺腺癌和鳞状细胞癌几乎不重叠共表达甲状腺转录因子-1 （thyroid transcription factor-1，TTF-1） 和p63；细胞角蛋白 （cytokeratin，CK）5和CK6是鳞状细胞癌的特异性标志物［7］；CK7是腺癌的特异性标志物［8］。目前上述指标相关检测常在术后切除病理组织上进行，不利于早期制定治疗方案，亦不适用于不宜手术的患者。因此，若能结合应用TBNA与病理分型分子标志物检测，则能很好解决2种诊断方法的不足。

本研究回顾性研究了TBNA获得的肺腺癌和鳞状细胞癌患者病理组织标本，通过实时PCR检测TTF-1、p63、CK5、CK7等标志物的表达水平，以评价各指标诊断肺癌病理分型的价值和准确性，并探究联合应用4种标志物进行综合诊断的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例样本

回顾性选取2015年7月至2016年12月间术后组织病理学检查确诊为肺癌的患者178例，其中男143例，女35例，平均年龄53.2 （35～77） 岁；组织学类型：鳞状细胞癌120例，腺癌58例。

1.2 组织样本的获得及总RNA的提取

首先经增强CT扫描等影像学检查，或在超声实时引导下，获得病变部位的准确定位信息。在支气管镜辅助下进行TBNA操作，利用特制的带有可弯曲导管的穿刺针 （专利号201720265388.7），通过气管镜的活检通道进入气管内，对纵隔内肿大的淋巴结或肿块进行穿刺，负压抽吸获取细胞及组织样本。在送检病理科后，留取剩余样本收集于细胞冻存管中，尽快放入液氮中保存待用。

待病理组织样本收集齐备，选取目标病理组织进行常规TRIZOL （美国Invitrogen公司） 提取RNA操作，并经紫外分光光度法定量，统一各病例RNA样本浓度后，进行下一步检测。

1.3 实时PCR检测TTF-1、p63、CK7、CK5的表达水平

取上述提取的定量后总RNA，在M-MLV逆转录酶 （美国Invitrogen公司） 的作用下，逆转录合成cDNA，并以该cDNA产物为模板进行实时PCR检测。目的基因的引物序列：TTF-1，正义5’-CGTTCTCAG TGTCTGACATCTTGA-3’，反义5’-CCTCCATGCCCA CTTTCTTG-3’；p63，正义5’-GGAAAACAATGCCCA GACTC-3’，反义5’-GCGCGTGGTCTGTGTTAAG-3’；CK7，正义5’-GTTCCATTTGCAAAGGCTGT-3’，反义5’-CAGGTGGTTACCCGAAAGA-3’；CK5，正义5’-A TCGCCACTTACCGCAAGCTGCTGGAGGG-3’，反义5’-AAACACTGCTTGTGACAACAGAG-3’；GAPDH，正 义5’-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3’，反 义5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35个循环。实验重复3次，应用2-ΔΔCt法进行分析。

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计分析。各标志物基因表达水平用±s表示；基因表达水平组间比较采用独立样本t检验；基因表达水平与病理分型的相关性采用Pearson相关分析；变量对病理分型的诊断价值采用受试者操作特征 （receiver operating characteristic，ROC） 曲线法进行分析。计数资料组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌病理分型分子标志物表达水平

实时PCR检测TTF-1、p63、CK7、CK5的表达水平。腺癌中各分子标志物的表达水平：TTF-1为1.732±0.243，p63为0.110±0.003，CK7为1.221±0.141，CK5为0.215±0.030；鳞状细胞癌中各分子标志物的表达水平：TF-1为0.107±0.004，p63为1.676±0.220，CK7为0.105±0.012，CK5为1.533±0.102。与腺癌相比，鳞状细胞癌中TTF-1 （P = 0.006）、CK7 （P = 0.012） 的表达水平显著降低，p63 （P = 0.008）、CK5 （P = 0.025）的表达水平显著升高。

2.2 建立多因素综合评分（total score，TS）诊断模型

采用Pearson相关分析确定各分子标志物基因表达水平与分型的相关性 （表1）。基于各基因表达水平与肺癌病理分型的相关系数 （r），建立TS诊断模型：TS=-0.672×TTF-1+0.778×p63-0.583×CK7+0.604×CK5，TS值越大则病理分型越倾向于鳞状细胞癌，TS值越小则病理分型越倾向于腺癌。

2.3 ROC曲线分析各指标诊断肺癌病理分型的价值

采用ROC曲线分析4种分型标志物与综合指标TS对肺癌病理分型的诊断价值 （图1），结果发现，TTF-1、p63、CK7、CK5表达水平诊断肺癌分型均有良好价值，但运用4个指标获得的综合指标TS进行病理分型诊断时，则最佳分界值的灵敏度 （0.942）和特异度 （0.841） 均最高，ROC曲线下面积亦最大（0.934），诊断价值最佳。

表1 分型标志物表达水平与肺癌病理分型的相关性分析Tab.1 Correlation between the expression of typing markers and the pathological typing of lung cancer

2.4 单因素和多因素诊断肺癌病理分型的准确性比较

图1 ROC曲线分析各指标单独及综合应用判定肺癌病理分型的价值Fig.1 Diagnostic value of each marker alone or in combination for the pathological typing of lung cancer，as determined by ROC curve analysis

分析4种分型标志物及综合指标TS对肺癌病理分型的准确性。结果发现，腺癌检出率最高的单因素指标为TTF-1 （45/88），鳞状细胞癌检出率最高的单因素指标为p63 （94/120），总检出率最高的单因素指标为p63 （76.4%）。采用χ2检验比较单一指标与综合指标检出率的情况，TS的腺癌检出率 （P =0.040）、鳞状细胞癌检出率 （P = 0.013） 及总检出率（P < 0.001） 均显著升高。见表2。

3 讨论

大部分肺癌患者在诊断时已无手术机会，需要全身化疗。越来越多的证据表明，肺腺癌和肺鳞状细胞癌治疗反应明显不同，这就推动了非小细胞肺癌精确的病理分型。如贝伐单抗禁用于鳞状细胞癌，这种药物增加鳞状细胞癌患者的肺出血风险［9］。因此，肺癌分型已经成为治疗的关键，并能够指导个性化治疗。对于无法获得手术切除标本的患者，通过TBNA获取病理组织则是解决病理分型问题的重要手段。而如何充分利用TBNA获取的小标本进行分型诊断，则具有重要临床意义。

表2 不同分型指标进行肺癌病理分型的检出率比较Tab.2 Comparison of the accuracy of pathological typing of lung cancer with different markers

本研究选择了TTF-1、p63、CK7、CK5等肺癌分型常见标志物，通过敏感度高、对样本量要求小的实时PCR法［10］进行检测，考察单因素和多因素诊断腺癌或者鳞状细胞癌的价值。TTF-1是诊断肺腺癌敏感度较高的检测因子，尽管在其他肿瘤也有表达，如神经内分泌肿瘤，但是都没有在肺腺癌中表达显著。p63是p53家族的新成员，与多种复层上皮原发性肿瘤的发生有关，在肺癌中主要在鳞状细胞癌中表达呈阳性。CK是细胞骨架的成份之一，其中相对分子量较高的CK5、CK6主要表达在鳞状上皮细胞及其肿瘤组织中，而相对分子量低的CK7则表达在腺上皮细胞及其肿瘤组织中。

与已有研究一致，本研究发现肺腺癌组织中TTF-1、CK7表达水平显著增高，肺鳞癌组织中p63、CK5表达水平显著增高。本研究应用Pe arson相关性分析，确立了各指标与肺癌分型的相关系数，建立综合4种标志物的多因素综合评分诊断模型TS。ROC曲线分析发现，相对于单因素诊断效果，多因素的TS具有更高的灵敏度和特异度。并且在对比诊断病理分型的准确性时，TS结果最好，总体检出率达到90.4%，远远高于各个单因素的诊断准确性。

综上所述，本研究的结果提示，利用TBNA获取肺癌患者病理组织，并基于实时PCR法进行肺癌分型重要分子标志物TTF-1、p63、CK7、CK5等的表达水平检测，是可行的病理诊断方法。且综合运用各分型指标进行诊断能够获得更高的诊断效率，这为肺癌病理分型诊断提供了新的检测思路。