较高温度对灵芝培养特性及灵芝酸产量的影响

刘月芹， 贺晓龙， 任桂梅

(延安大学 生命科学学院，陕西 延安 716000)

灵芝(Ganodermalucidum)别名赤芝、灵芝草、仙草、红芝、神芝、丹芝、瑞草、神草、万年蕈，俗称木灵芝。属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)多孔菌目(Polyporales)灵芝属(Ganoderma)，是热带、亚热带地区生长发育的高温型菌类，在我国东北、华北以南地区均有分布。灵芝具有较高的营养、保健和医疗价值[1]，是中国传统药用真菌，广泛应用于人类各种疾病的预防和治疗。灵芝含有三萜类化合物、灵芝多糖、有机锗、硒、核苷酸、甾醇类、氨碱类、多肽类等160多种药用活性成分。灵芝酸是灵芝三萜类化合物，具有保肝、抗肿瘤、抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、抑制组胺释放、抑制胆固醇合成、镇痛、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[2-4]。灵芝酸含量的高低已成为衡量灵芝质量高低的重要指标[5]。目前对灵芝酸的研究热度和需求不断增加，然而灵芝酸在灵芝子实体中含量较低且灵芝生长周期较长，不利于大量生产及商业化应用。近年来，灵芝液体发酵技术不仅具有培养周期短、易控制的特点，还具有连续大量生产活性成分的优势。目前的研究热点主要是通过添加诱导子[6-13]和发酵条件优化两种方法来提高灵芝酸的含量。然而对于灵芝酸发酵条件的优化研究主要集中在通过优化培养基成分、pH值、氧浓度等[14-18]方面。温度对灵芝液体发酵的影响研究不多，为此本研究探讨了较高温度培养对灵芝液体发酵过程中各项生理指标的影响，为灵芝酸的高效生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 灵芝菌株(G.lucidumCGMCC 5.616) 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存于4 ℃冰箱PDA斜面培养基。

1.1.2 培养基 ①种子液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，去离子水1 000 mL，pH 5.5；②种子固体培养基：在种子液体培养基基础上添加琼脂20 g；③液体发酵培养基：马铃薯200 g，葡萄糖30 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 2 g，维生素B 0.02 g，去离子水1 000 mL，pH 5.5。

1.1.3 主要试剂 3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS)，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)，蒽酮，浓硫酸，氯仿，NaHCO3，乙酸，乙腈。DNS和ABTS购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器与设备 超净工作台(VS-1300U，苏州净化设备有限公司)；超低温冰箱(DW-86L388，青岛海尔特种电器有限公司)；恒温干燥箱(BPG-9156A，上海一恒)；恒温培养箱(DHP-9902，上海一恒)；恒温水浴锅(HWS-26，上海一恒)；紫外可见光分光光度计(UV-1200，上海美谱达)；组合式光照振荡培养箱(ZQZY-BG，上海知楚)；高速冷冻离心机(5424，德国艾本德)；高效液相色谱仪(美国Agilent1100)。

1.2 方法

1.2.1 培养方案 采用振荡与静置相结合的分段培养方案。种子液的制备：保存于4 ℃斜面培养基上的灵芝菌株经活化后，重新保存于PDA平板培养皿中。将平皿中的菌丝用灭过菌的直径为1 cm的打孔器取6块定量接种于盛有45 mL种子液体培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、120 r/min避光振荡培养7 d。发酵培养：将上述得到的种子液按10%(体积分数)的接种量接种于盛有90 mL发酵培养液的500 mL三角瓶中，分别置于30、32、34、36 ℃恒温摇床180 r/min先振荡培养2 d，然后静置培养至12 d，发酵培养期间，每隔2 d，每个温度下取样3瓶，用来测量生物量﹑可溶性糖﹑胞外酶活及灵芝酸生成量。所有实验均重复3次。

1.2.2 生物量测定 定时取样，用50 mL离心管收集菌丝，经10 000×g离心20 min，沉淀下来的菌丝经去离子水清洗3遍后放在已经烘干至恒重的滤纸上，在50 ℃干燥箱中烘干至恒重后称重。称重结果减去滤纸重即为生物量。

1.2.3 可溶性糖含量检测 可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[19]。定时取适量发酵液，4层纱布过滤，静止5 h，经10 000× g离心5 min后，取1 mL上清液加入10 mL蒽酮试剂(蒽酮150 mg溶于稀硫酸100 mL(浓硫酸76 mL加水30 mL))，摇匀后置90 ℃保温15 min，最后冷却至室温，620 nm测OD值。

1.2.4 胞外酶活测定 从第2天开始，每隔2 d取样，发酵液用50 mL离心管收集菌丝，经10 000× g离心20 min后，上清液即为粗酶液。得到粗酶液后进行适当稀释，然后对淀粉酶﹑羧甲基纤维素酶及漆酶酶活进行测定。连续测定6次。淀粉酶酶活用DNS法测定，1个酶活单位(1U)定义为在pH 5.6、40 ℃条件下，每分钟生成1 μmol麦芽糖所需的酶量[20]。羧甲基纤维素酶活性用DNS法测定，1个酶活单位定义为在50 ℃，相应pH条件下，每分钟生成1 μmol葡萄糖所需的酶量[20]。漆酶酶活采用ABTS法测定，1个酶活单位定义为反应体系中每分钟使ABTS溶液产生1 μmol ABTS自由基的酶量[20-21]。

1.2.5 灵芝酸提取与测定 取适量发酵液，经10 000×g离心5 min后，取上清液，使其在50 ℃下真空浓缩至膏状，得到提取物浸膏，并用氯仿溶解，反复用水萃取6次，取氯仿层，然后再用5%(质量分数)NaHCO3溶液进一步萃取3次，取NaHCO3萃取层，用2 mol/L HCl 调节NaHCO3萃取液pH<3。最后，沉淀物再用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸，浓缩至干成固体粉末，得到粗灵芝酸。灵芝酸含量的测定采用HPLC法[18，22]，测定条件为色谱柱Agilent Hpersil (5 μm×4.6 mm×250 mm)；流动相：V2%乙酸∶V2%乙腈=7∶3；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温：室温；检测波长282 nm。

1.2.6 数据统计分析 所有重复实验的数据均用mean±SD表示。利用SPSS15.0进行方差分析，多重比较不同温度下的显著性差异。P< 0.05为有显著差异；P<0.01为有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 温度对灵芝菌丝生长的影响

灵芝属高温性菌类，根据灵芝的适应温度生长范围设置了30、32、34、36 ℃四个温度，详细探讨较高温度发酵对灵芝菌丝生长的影响，结果如表1所示。从表1可以看出，30 ℃下灵芝菌丝的生长状况最好，然而随着发酵温度的升高，其生物量呈下降的趋势；32和34 ℃培养温度下不同培养时间的生物量相比对照组(30 ℃)有一定的降低，但差异不明显；36 ℃培养温度下不同培养时间的生物量相比对照组普遍降低了30%以上，差异显著(P<0.05)。34 ℃下的生物量比32 ℃下的稍低，但差异不明显，不具有统计学意义。而36 ℃下的生物量相比于34 ℃(P=0.048 22)和32 ℃下的生物量(P=0.041 34)差异显著，下降明显，均具有统计学意义。同时从表1可以发现，在第10 天不同发酵温度下的生物量达到最大值，而随着培养时间延长至12 d，其生物量呈现下降趋势。

表1 不同发酵温度下的灵芝生物量

注：表中数据为平均值±标准差；同行不同小写字母表示相同培养时间不同培养温度在0.05水平存在显著差异，下图表同

2.2 温度对灵芝几种胞外酶活的影响

温度是影响酶活的一个重要因素，而微生物最适生长温度并不等于最适发酵温度，也不等于积累代谢物的最适温度。较高的发酵温度会提高细胞内相关酶的酶活，从而一定程度上提高目标产物的产量。基于此，研究了较高温度对灵芝液体发酵中几种胞外酶的酶活影响。由表2可知，淀粉酶酶活随着发酵温度的升高而提高。32 ℃培养条件下，除了第10天的淀粉酶酶活相比对照组有显著提高外(P<0.05)，其他不同培养时间的酶活提无统计学意义。34 ℃培养条件下，从第6天开始，淀粉酶酶活相比对照提高了30%以上，差异显著(P<0.05)。36 ℃培养条件下不同培养时间的淀粉酶酶活相比对照提高了25%～70%，差异显著(P<0.05)。虽然36 ℃下的淀粉酶酶活高于34 ℃，但两温度下的酶活差异不显著。结果表明，较高的发酵温度可提高淀粉酶的酶活。同时，从表2中可以发现在培养的第4天，不同培养温度条件下，其淀粉酶的酶活是最高的。但是随着培养时间的延长，其酶活逐渐降低。这一研究与陈国梁等[23]及杨舒贻等[24]对于淀粉酶活性变化趋势相一致。马铃薯富含淀粉，淀粉是灵芝菌丝生长的重要营养源。所以在发酵前期，菌丝的生长需要淀粉酶的高酶活将淀粉分解成可溶性糖从而满足菌丝对营养素的需要。但随着菌丝的快速生长，培养液中的淀粉被慢慢消耗，从而影响到菌丝的进一步生长，进而导致酶活的下降。而在相同培养条件下，漆酶和纤维素酶酶活却呈现出随着培养时间的延长先升高再降低的现象(表3、表4)。漆酶是与木质素降解有关的氧化酶，降解的木质素为菌丝提供营养[25]。漆酶在培养前期酶活很低，且增长比较缓慢。32 ℃培养条件下，2～8 d培养时间里漆酶的酶活相比对照组有显著提高(P<0.05)，34 ℃培养条件下不同培养时间的漆酶酶活相比对照组提高了50%～200%，差异显著(P<0.05)。36 ℃下的漆酶酶活虽然低于34 ℃，除了第4天的酶活下降显著外，其他培养时间酶活降低不显著，不具有统计学意义。纤维素酶前期的酶活比漆酶酶活要高，32 ℃培养条件下不同培养时间的纤维素酶酶活相比对照组无显著性提高。34 ℃培养条件下，2～10 d培养时间里的纤维素酶酶活相比对照组提高了25%～75%，差异显著(P<0.05)。36 ℃发酵条件下的酶活相比34 ℃下的酶活有明显下降，除了发酵的第10天，纤维素酶酶活相比对照组有显著下降外(P<0.05)，其他培养时间两温度下的纤维素酶酶活差异不显著。同时，从表3和表4中还可以发现在发酵的第10天，各培养温度下的漆酶和纤维素酶酶活达到最大，第12天酶活都普遍下降。这可能是菌丝生长前期所需的营养物质是淀粉，对于木质素﹑纤维素的分解利用比较低，而后随着淀粉酶活性的降低，淀粉含量减少，这时为满足菌丝的继续生长，为其提供丰富的营养，漆酶和纤维素酶的活性就会升高。以上结果表明34 ℃发酵温度更有利于漆酶﹑纤维素酶发挥酶活。

表2 不同发酵温度下的淀粉酶活性

表3 不同发酵温度下的漆酶活性

表4 不同发酵温度下的羟甲基纤维素酶活性

2.3 温度对灵芝可溶性糖含量的影响

温度会影响胞外酶的酶活，而酶活的高低直接影响细胞对营养物质的分解利用。如图1所示，随着培养温度的升高和培养时间的延长，不同发酵温度下的可溶性糖含量均呈先升高再降低的趋势，这与漆酶﹑纤维素酶酶活变化规律一致。32 ℃培养条件下，不同培养时间的可溶性糖含量相比对照组有一定的提高，但无显著性差异，而34和36 ℃发酵温度下的可溶性糖含量明显高于对照组，且差异显著(P<0.05)。从图1中还可以发现，36 ℃培养条件下的可溶性糖含量相比34 ℃下的含量有一定的降低，但两温度下的可溶性糖含量无显著性差异，而且36 ℃培养条件下的可溶性糖含量仍高于30、32 ℃，且34 ℃发酵温度下的可溶性糖含量在第10天达到最高，比对照组的可溶性糖含量提高了45.13%，差异显著(P<0.05)。虽然在培养的第10天淀粉酶的酶活不是很高，但是漆酶和纤维素酶的酶活都达到最高，这样可能导致了可溶性糖的含量也最高。同时结合表1，可以发现可溶性糖含量最高时对应的灵芝菌丝体的生物量也是最高的。

图1 不同发酵温度下的可溶性糖含量Fig.1 The soluble sugar content of different fermentation temperatures

2.4 温度对灵芝酸生物合成的影响

温度会影响微生物的新陈代谢，通过改变代谢途径中的酶活从而影响代谢产物的含量。由上述较高温度发酵对灵芝几种胞外酶活性的研究表明，在一定的温度范围内会一定程度上提高各种代谢酶的酶活。由图2可见，随着培养温度的升高和培养时间的延长，不同发酵温度下的灵芝酸含量都在第10天达到最高，而后呈现再降低的现象，这一趋势与前述的可溶性糖含量﹑漆酶和纤维素酶酶活变化规律一致。而且32、34、36 ℃发酵温度下第10天灵芝酸的含量比对照组分别提高了8.21%、13.21%、3.73%。发酵第12天，32、34 ℃发酵温度下灵芝酸含量比对照组分别提高了13.41%、20.58%，而36 ℃发酵条件下灵芝酸含量却低于对照组。32和36 ℃培养条件下，不同发酵时间灵芝酸产量虽然高于对照组，但无显著性差异，而34 ℃培养条件下的不同发酵时间灵芝酸产量相比对照组均有明显提高且差异显著(P<0.05)。结合上述较高温度发酵对灵芝液体发酵过程中生物量﹑胞外酶及可溶性糖含量的研究表明，在培养第10天，灵芝生物量﹑可溶性糖含量及胞外酶酶活均达到最高，灵芝酸含量也达到了最高值。灵芝酸是次级代谢产物，在发酵的第12天，由于营养物质的消耗，生物量降低等原因使灵芝酸呈现下降趋势。同时可以发现如果发酵温度太高，生物量和胞外酶活都不高，就可能导致灵芝酸产量下降。所以适合的发酵温度和发酵时间是提高灵芝酸产量的有效方法。

图2 不同发酵温度下的灵芝酸产量Fig.2 The ganoderic acid yield of different fermentation temperatures

3 讨 论

温度是影响灵芝生长发育的重要环境因素，可显著影响灵芝活性成分的含量变化[26]。而目前的研究主要集中于温度对灵芝菌丝生长、子实体产量及营养代谢的影响[27-28]。对于温度对灵芝液体深层发酵培养特性及相关活性成分的研究很少[29-30]。微生物细胞内的代谢酶一般需要在较高温度下才能发挥到最佳酶活，这一温度多半情况下是高于微生物最适生长温度的，而代谢酶酶活的提高有利于代谢产物的高效合成。本研究发现，30 ℃(对照组)培养条件下的菌丝生长状态最好，随着发酵温度的升高和培养时间的延长，灵芝菌丝生物量有明显下降，尤其是36 ℃培养条件下，其生物量比对照组下降了30%以上。这表明发酵温度过高会严重影响菌丝的生长，与汪金萍等[30]的研究结果一致。在整个发酵期间，较高的发酵温度提高了灵芝胞外酶的酶活。淀粉酶的最高酶活出现在36 ℃发酵条件下的第4天，漆酶和纤维素酶的最高酶活出现在34 ℃发酵条件下的第10天。魏巍等[28]的研究表明随着培养温度的升高，灵芝的漆酶和纤维素酶的酶活也不断提高，较高的温度有利于酶的分泌。所以我们可以得出较高温度发酵提高了灵芝相应代谢酶的酶活。而可溶性糖和灵芝酸含量变化与胞外酶酶活密切相关，酶活的提高使两者的含量也相应提高。魏巍等[28]的研究也表明随着培养温度的提高，不同基质部位的总糖含量一直呈升高趋势。可溶性糖和灵芝酸含量最高在34 ℃发酵条件下的第10天，比对照组的可溶性糖含量、灵芝酸产量分别提高了13.21%、45.23%。随着发酵温度的进一步升高和培养时间的延长都会使可溶性糖含量、灵芝酸产量降低。这可能是由于营养物质的消耗和一些副产物的生成所致。

本研究证实液体培养条件下，温度对灵芝的生长发育及代谢调控有显著影响，较高的温度提高了灵芝代谢酶的酶活和相应代谢产物的产量，且灵芝生物量高并不代表其代谢产物的产量也高。对于灵芝酸的发酵生产来说，可能较高温度的发酵提高了灵芝酸合成途径中相关酶的酶活从而更有利于灵芝酸的生物合成。这为灵芝酸的代谢调控及高效合成提供了新的思路和方法。