间日疟原虫感染患者T细胞应答相关趋化因子水平的检测

洪民生， 曾 婕， 李丹妮， 王庆辉， 曹雅明

(中国医科大学基础医学院 免疫学教研室，辽宁 沈阳 110122)

间日疟原虫(Plasmodiumvivax)是可引发人类疟疾的一种寄生原虫，广泛分布于热带和亚热带地区[1-2]。最新报道显示，2016年全球91个国家受到疟原虫感染的威胁，疟疾死亡病例达44.5万[3]。东南亚地区和南美是间日疟感染最为严重的区域[3]。在我国，疟疾主要以间日疟感染为主。虽然近年来由于中央和地方各级政府对疟疾防控工作的支持和投入，使局部地区疟疾疫情得到有效遏制，但在疟疾高发的边境地区，疟疾的流行直接影响到我国疟疾的发生。据报道中缅边境地区输入性间日疟感染占73.4%。因此，控制和消灭疟疾仍然是国际社会的共同目标。抗疟免疫机制的解析是研发有效疫苗，制定疟疾防控策略的前提。研究表明保护性疟疾免疫很大程度上与T细胞应答密切相关[4-5]。疟原虫子孢子经蚊叮咬后输入人体，在肝细胞内发育成子孢子后，入侵红细胞，进行裂体增殖，引发疾病症状。我们的前期结果显示，在疟原虫感染的红内期阶段，CD4+T细胞发挥关键的抗疟保护效应。CD4+Th1细胞分泌IFN-γ遏制疟原虫的爆发性增殖。CD4+Th2细胞辅助B细胞产生特异性抗体，有效清除疟原虫，防止复发和再燃[6-9]。CD8+T细胞被认为是抗肝期疟原虫感染的重要细胞。免疫细胞的募集和功能的调节受制于趋化因子的表达。疟原虫感染可促发不同趋化因子的水平变化。有资料显示，CXCR3的配体CXCL9与CXCL10在伯氏疟原虫感染鼠的脑中高度表达。与野生型小鼠相比，CXCR3缺陷小鼠对脑疟具有明显的保护作用，且脑内T细胞明显减少[10]。疟疾感染人群也伴有不同程度趋化因子水平的变化。然而，目前我国主要疟疾输入地区——中缅边境地区疟疾感染患者体内免疫细胞和趋化因子的表达水平尚未见报道。因此，本研究通过检测中缅边境地区间日疟感染患者血浆中T细胞应答相关的趋化因子水平，分析其对T细胞亚群表达的影响，进而为疟疾免疫干预策略的确立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本收集 在收到知情同意书，符合伦理标准的前提下，由从事医学相关专业人员于2015年6至11月选择中缅边境地区间日疟感染患者54人，当地未感染正常对照人群22人，共76人。采集患者血浆54份，单个核细胞36份，及正常对照血浆22份。同时记录基本信息，并由专业人员制备血涂片，显微镜下观察疟原虫感染率。

1.1.2 仪器与试剂 流式细胞仪(FACSCelesta，Becton Dickinson，US.)；Luminex 200(Luminex Corporation，US)；Bio-Plex human chemokine kit(Bio-Rad)；BV-421-conjugated anti-human CD4及其同种型抗体(BD Horizon)；BV-605-conjugated anti-human CD8抗体及其同种型抗体(Biolegend)。

1.2 方法

1.2.1 样本收集与处理 根据患者意愿，同意同时收集血浆和单个核细胞的患者，按照静脉血采集程序采集静脉血8～10 mL，注入BD Vacutaine®一次性使用真空静脉血样采集容器，垂直放置于离心机，1500RCF，常温离心20 min；分离血浆，-80 ℃保存；取含有单个核细胞的灰白层，溶于PBS，离心后，细胞计数，加入细胞冻存液，液氮保存。单纯取血浆的患者，常规采集静脉血2 mL，离心分离血浆，-80 ℃保存。

1.2.2 Bio-plex Pro human Chemokine试剂盒检测趋化因子 按照伯乐公司试剂盒的说明书操作步骤分别检测人血浆样本中趋化因子(CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL13和CCL1)表达水平。标准品和血浆样本分别用标准品稀释液和样本稀释液4倍稀释。检测板每孔加入50 μL偶联相应趋化因子抗体的磁性微球，在磁力板上用洗液清洗2次，然后分别加入标准品和待检样本，同时设空白孔，避光常温震荡孵育1 h。洗板3次后，加入检测抗体，震荡孵育30 min后再次洗板3次。加入SA-PE赋予10 min，震荡清洗3次后，加入125 μL分析缓冲液，震荡后，置于Luminex 200检测每孔荧光值。以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，计算各样本的趋化因子含量(pg/mL)。

1.2.3 流式细胞仪检测单个核细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群比例 常规细胞复苏后，取1×106/mL单个核细胞悬液0.1 mL，PBS洗涤后，加入抗人CD4和CD8的荧光抗体孵育30 min，PBS洗涤后，利用流式细胞仪检测细胞亚群比例。

1.2.4 统计分析 应用SPSS 22统计学分析软件分析数据，采用非参数检验比较各组中位数的统计学差异。Spearman分析患者趋化因子表达水平与年龄的相关性。P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 患者基本情况

在中缅边境疟疾流行区共收集54例间日疟原虫感染病例，其中男性41例，女性13例，平均年龄(30.33±11.80)岁，年龄范围15～66岁。40例(74.1%)的患者就诊时有发热症状(>37.5 ℃)，镜检间日疟原虫感染密度的中位数(四分位距)为1 804(708～6 180)个疟原虫/μL血。

2.2 间日疟原虫感染患者血浆趋化因子的表达变化

在中缅边境疟疾流行区分别采集正常无感染人群和间日疟原虫镜检阳性感染患者的血浆，经Bio-plex试剂盒检测与T细胞应答相关的趋化因子(CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL13和CCL1)的表达水平。结果显示，与正常无感染对照人群(Con)相比，间日疟原虫感染患者(Pv)血浆中上述趋化因子的表达水平均出现不同程度的升高，提示这些趋化因子在间日疟原虫感染过程中发挥一定作用(图1)。

2.3 间日疟原虫感染患者血浆趋化因子水平与年龄的相关性

分析间日疟感染患者血浆趋化因子表达水平与患者年龄的相关性，Spearman分析结果显示，CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的表达水平与患者的年龄(Age)呈一定正相关，但只有CXCL10和CXCL13的相关性具有统计学差异(图2)。

图1 中缅边境地区间日疟感染患者血浆趋化因子的水平检测

图2 中缅边境地区间日疟感染患者血浆趋化因子水平与年龄的相关性Fig.2 The correlation between the age and the levels of chemokines in the plasma fromP.vivaxinfections along China and Myanmar*P<0.05，**P<0.01

2.4 不同性别的间日疟原虫感染患者血浆趋化因子水平比较

分析不同性别的间日疟感染患者血浆趋化因子表达水平差异，结果显示，男性患者(Male)和女性患者(Female)血浆中的CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CCL13和CCL1的表达水平无显著性差别(图3)。

2.5 间日疟原虫感染患者血浆趋化因子水平与患者体温的相关性

进一步分析间日疟感染患者血浆趋化因子表达水平与患者体温(Body temperate)的相关性，Spearman分析结果显示，CXCL9和CXCL10的表达水平与患者的体温呈负相关趋势，而CCL1的水平与患者体温呈正相关趋势，但是均无统计学差异(图4)。

图3 不同性别中缅边境地区间日疟感染患者血浆趋化因子水平Fig.3 The levels of chemokines between female and maleP.vivaxinfections along China and Myanmar

图4 中缅边境地区间日疟感染患者血浆趋化因子水平与体温的相关性Fig.4 The correlation between the body temperature and the levels of chemokines in the plasma fromP.vivaxinfections along China and Myanmar

2.6 表达不同水平T细胞的间日疟原虫感染患者趋化因子水平比较

分离36例间日疟感染患者外周血中单个核细胞，流式细胞仪检测单个核细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，结果显示患者CD4+T细胞比例的中位数(四分位距)为34%(25%～41%)，CD8+T细胞比例的中位数(四分位距)为15%(11%～20%)。以中位数为界限，分别将CD4+T细胞和CD8+T细胞分为高、低两组，比较表达不同水平T细胞的间日疟原虫感染患者血浆中各趋化因子的表达水平(表1)。结果显示，与CD4+T细胞低表达患者相比，CD4+T细胞高表达患者的CXCL9，CXCL10和CXCL13表达水平有增高趋势，但只有CXCL10的差异具有统计学意义。CXCL13、CCL13和CCL1水平未见明显差异。不同CD8+T表达水平的患者未检测到差异性表达的趋化因子。

表1 表达不同水平T细胞的间日疟原虫感染患者的趋化因子水平

注：Median：中位数；IQR：四分位距；*P<0.05

3 讨 论

我国疟疾的发生直接受到中缅边境疟疾高发区疫情的影响。我们前期在中缅边境那邦地区进行的疟疾流行病学调查显示，边境地区的疟疾疫情依然十分严峻，间日疟感染普遍存在[11-12]。耐药虫株的出现进一步加大了疟疾防控的难度。因此，深入了解宿主抗疟免疫状态，将为进一步研制有效的疟疾疫苗提供参考。然而，目前中缅边境地区疟疾感染人群相关免疫指标的检测却鲜有报道。

T细胞在抗红内期疟原虫免疫应答中起到举足轻重的作用[6-9,13]。疟原虫感染红细胞可表达多种抗原成分，被宿主免疫系统的抗原提呈细胞摄取，加工处理后，提呈给T淋巴细胞，启动适应性免疫应答，清除疟原虫感染。T细胞的两个主要亚群CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗疟原虫免疫应答中发挥作用的时相有所不同。CD8+T细胞被认为是抗肝期疟原虫感染的重要细胞，而在红内期阶段，由于成熟红细胞MHC I类分子表达缺失，限制了CD8+T细胞作用的发挥。尽管有研究表明间日疟原虫感染的网织红细胞可表达MHC I类分子而成为CD8+T细胞杀伤的靶点[14]，但目前CD8+T细胞在抗疟原虫红内期免疫应答中的重要性尚不十分清楚。我们以往的研究表明CD4+T细胞被认为是抗红内期免疫的重要细胞，在感染初期，CD4+Th1细胞通过分泌Th1型细胞因子，介导细胞免疫应答，激活具有杀伤作用的巨噬细胞，释放一氧化氮，杀伤疟原虫，控制原虫密度的增长。后期CD4+Th2型细胞活化，介导适应性体液免疫应答，诱导特异性抗体产生，最终清除疟原虫[15]。

研究发现疟疾感染患者出现不同程度趋化因子的变化，并常被用作鉴定疟原虫感染的敏感性生物指标[16-17]。不同细胞的募集受控于不同趋化因子的表达水平。因此，确定对T细胞亚群募集起到关键性作用的趋化因子，对进一步解析和调控抗疟免疫机制具有重要意义。本研究检测了中缅边境地区间日疟原虫感染患者血浆中T细胞应答相关的六种趋化因子，发现在急性感染期这六种趋化因子均有不同程度的升高，其表达水平与性别无关。而这些因子中CXCL10和CXCL13与患者的年龄呈正相关，提示随着年龄的增高，免疫系统逐渐成熟，疟原虫感染后，免疫系统可产生应答，引起趋化因子的升高。CXCL9、CXCL10和CCL1虽与患者体温有一定相关趋势，但是差异无统计学意义，因此，今后将进一步增加样本量，检验其与体温的相关性。CXCL9、CXCL10和CXCL11与Th1细胞和CD8+T细胞表面受体CXCR3结合，可进一步促进细胞免疫应答[18-20]。而CXCL13、CCL13和CCL1通常被认为可趋化Th2型细胞，增强体液免疫应答[18]。本研究显示，在急性感染期Th1和Th2型免疫应答相关趋化因子的普遍升高，提示间日疟原虫感染可有效调动机体的适应性免疫应答。

按照感染患者外周血T细胞亚群的表达水平，分别将CD4+T细胞和CD8+T细胞分成高、低两组感染人群，比较高低两组人群中趋化因子的表达水平，结果显示Th1型免疫应答相关的趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在CD4+T细胞高表达组呈现升高趋势，特别是CXCL10的升高具有统计学差异；而Th2型免疫应答相关的趋化因子CXCL13、CCL13和CCL1的表达在两组人群中未见显著性差异，由此提示，CXCL10可能通过与CXCR3受体的结合募集CD4+Th1型细胞，成为启动Th1型应答的关键。因此，以CXCL10为靶点，在间日疟感染急性期适时地调控机体的免疫应答类型，将有望更加有效地控制疟疾感染。