不同类型猪舍内气溶胶中致病菌数量和内毒素水平的比较研究

许铭洙，张 勇，郭振东，严鸿林，*，张宏福，刘静波，

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，长春 130122；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

当前我国集约化规模化的养猪生产模式养殖密度大、猪舍全封闭且猪舍空间相对有限。这种全封闭且高密度的养殖模式相对于传统的开放式和低密度养殖模式，猪舍中气溶胶的浓度显著增加，进而加剧对饲养人员和舍内动物呼吸道的刺激，增加了养猪生产从业人员和猪只本身患呼吸道疾病的风险。陈冠希等[1]用猪舍气溶胶处理小鼠导致了其肺脏的组织病理变化并提高了肺脏中炎性因子的表达。猪舍气溶胶中的致病微生物和内毒素可能是引起上述问题的主要原因[2]。前人研究表明，全封闭式猪舍气溶胶中含有大量的致病菌和内毒素，其中主要致病菌为弯曲杆菌（Campylobacter）、产气荚膜梭状芽孢杆菌（C.perfringens）、肠球菌（Enterococcus）和大肠埃希菌（E.coli），且致病菌和内毒素的水平受诸多环境因素的影响[3]。空气中的内毒素含量与需氧菌丰度存在一定的相关关系，特别是与其中需氧的革兰氏阴性菌的水平存在正相关关系[4]。猪舍气溶胶中微生物主要来源于猪粪便，分子生物学和高通量测序手段均揭示猪粪便微生物组成与猪舍气溶胶微生物组成存在极大的相似性[5-6]。前人研究也发现，影响猪粪便微生物的处理手段同样也能改变猪舍气溶胶微生物的组成[7]。猪的粪便微生物组成受诸多因素的影响，其中不同生产阶段的猪粪便微生物组成存在显著差异[8]。P.Y.Hong 等[7]研究表明，不同的生产阶段可影响猪舍气溶胶的微生物组成，再次证明猪粪便微生物组成和猪舍气溶胶微生物组成的关联性。但是不同的生产阶段对猪舍气溶胶中致病微生物数量和内毒素含量是否也有着显著的影响，目前尚不可知。

在现代养猪生产中，不同生产阶段的猪独立饲养于不同类型的猪舍中，主要分为保育舍、生长育肥舍、妊娠舍和分娩舍。这4 种类型的猪舍与所圈养的猪只生产阶段相对应，且养殖密度和猪舍环境参数如温湿度明显不同。除上文所述猪只粪便微生物在很大程度上决定了猪舍气溶胶微生物的组成外，猪舍环境参数同样也对猪舍气溶胶微生物组成有着极大的影响[6]。鉴于不同类型猪舍中猪只微生物组成以及环境参数的差异，我们推测不同的猪舍类型对气溶胶中致病微生物和内毒素有着显著的影响。

本研究通过比较不同类型猪舍内气溶胶中Campylobacter、C.perfringens、Enterococcus 和E.coli的数量及内毒素的含量，旨在考察猪舍类型对气溶胶中致病微生物数量和内毒素含量的影响，为进一步探明猪舍气溶胶的致病机理提供参考和积累资料。

1 材料和方法

1.1 试剂、材料与仪器

无热源质生理盐水（湛江安度斯生物有限责任公司）；

LAL试剂盒（QLC-100BioWhittaker，Walkersvile，MD）；

安德森6 级撞击式采样器（辽宁市医疗器械厂）；

AGI-30 空气采样器（Ace Glass，Inc.，Vineland，NJ，USA）；

电热恒温培养箱（DH4000A 型，天津泰斯特仪器有限公司）；

NanoDrop ND-1000（Nanodrop Technologies，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）；

ABI7600 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）；

酶标仪（Tecan，Austria）。

1.2 试验设计

选择32 栋封闭式猪舍进行空气样品采集，共4种类型猪舍，分别为保育舍、生长育肥舍、妊娠舍和分娩舍，每种类型猪舍各8 栋，试验圈舍饲养猪只品种为DLY。保育舍和生长育肥舍大小均为36 m×9 m×3.5 m，保育舍内两列共24 个猪栏和一条走廊，饲养约480 头仔猪，舍内温度27 ℃左右；育肥舍两列共24 个猪栏和一条走廊，饲养约200 头育肥猪，舍内温度20 ℃左右。妊娠舍大小为32 m×8 m×3.5 m，舍内设两列限位栏和3 条走廊，饲养100 头妊娠母猪，舍内温度20 ℃左右。分娩舍大小为30 m×8 m×3.5 m，舍内设两列产床和3 条走廊，饲养30 头哺乳母猪，舍内温度22 ℃左右。所有猪舍采用隧道式通风，安有两个换气风扇，通风良好，舍内均铺板条式漏粪地板并设排粪暗沟，猪舍湿度控制在60%左右。于2017年7月20日采用AGI-30 收集器采集空气样品用于致病菌丰度和内毒素含量的测定，同时采用安德森6 级采样器采集空气样品用于需氧菌含量的测定。

1.3 空气样品采集

将安德森6 级撞击式采样器置于猪舍中央，高度0.8 m，以5%的公绵羊血琼脂培养基为采样介质，采集时空气流量为28.3 L/min，采样时间为10 min。

将AGI-30 空气采样器放在猪舍的中央，离地面1.0 m 处，以20 mL 无热源的生理盐水为采样介质，采样时气流速度为12.5 L/min，采样时间为48 min。每栋猪舍采集4 个平行样品。将其中两个平行样品混合并加入无热源的生理盐水定容至50 mL，该终溶液所代表的总空气流量即为1 200 L 采集样品；将其余两个平行样品混合同样定容至50 mL。前处理完毕后，将每栋猪舍所采集的两个生物气溶胶溶液置于-20 ℃冰箱进行保存，一份用于后续DNA 提取，另一份用于内毒素的测定。

1.4 猪舍气溶胶中需氧菌数量的测定

对每栋猪舍，安德森6 级撞击式采样器可采集6 种不同颗粒直径范围的气溶胶，将已吸附气溶胶样品的6 个培养基置于恒温箱中37 ℃需氧培养48 h，记录需氧菌菌落数。将每栋猪舍中用安德森6 级采样器采得的6 个琼脂平板上的需氧菌菌落数代入ANDERSON 校正表进行校正，计算出每栋猪舍所采集的6 节平皿上需氧菌菌落数量的校正总和。根据总通气量（283 L），计算每立方米猪舍空气中需氧菌的浓度。

1.5 猪舍气溶胶DNA 提取和致病菌丰度的测定

表1 荧光定量微生物引物序列Table 1 Primer sequences used to measure pathogens abundances

1.6 猪舍气溶胶中内毒素含量的测定

对AGI-30 采集到的气溶胶溶液解冻后，于428 r/min 离心10 min 并收集上清液用于内毒素含量的测定。猪舍气溶胶中内毒素的测定采用酶标仪和LAL 试剂盒进行，测定步骤按试剂盒说明书进行。根据样本和标准样本在405～410 nm 波长处的OD 值计算样本中的内毒含量，并根据总通气量计算每立方米猪舍空气中的内毒素含量。

1.7 数据统计与分析

由于所有原始数据均不符合正态分布，对数据进行Log10 转化后采用SAS 统计软件中的Mixed程序分析差异显著性，事后多重比较采用Turkey 法进行。以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 猪舍类型对气溶胶中需氧菌丰度的影响

由图1可知，不同类型猪舍气溶胶需氧菌数量存在显著差异（P＜0.05）。保育舍来源的气溶胶中需氧菌丰度显著高于育肥舍、妊娠舍和分娩舍（P＜0.05），且保育舍气溶胶需氧菌丰度分别是育肥舍、妊娠舍和分娩舍气溶胶需氧菌丰度的3.28、3.44 和9.42 倍。此外，育肥舍和妊娠舍来源气溶胶中需氧菌丰度显著高于分娩舍（P＜0.05）。

图1 猪舍类型对气溶胶中需氧菌丰度的影响Figure 1 Effects of piggery types on aerobic bacterial abundance in aerosol

2.2 猪舍类型对气溶胶中致病菌丰度的影响

由表2可知，猪舍类型对气溶胶中致病菌Campylobacter 和E.coli 的数量有显著的影响（P＜0.05）；保育舍来源的气溶胶中Campylobacter 和E.coli 的数量显著高于其他类型的猪舍（P＜0.05）；育肥舍、妊娠舍和分娩舍气溶胶致病菌数量没有显著差异（P＞0.05）。

2.3 猪舍类型对气溶胶中内毒素含量的影响

由图2可知，不同猪舍类型气溶胶内毒素含量存在显著差异（P＜0.05）。保育舍来源的气溶胶中内毒素含量显著高于育肥舍、妊娠舍和分娩舍（P＜0.05）；育肥舍、妊娠舍和分娩舍气溶胶内毒素含量没有显著差异（P＞0.05）；保育舍气溶胶内毒素含量分别是育肥舍、妊娠舍和分娩舍气溶胶内毒素含量的5.56、3.63 和5.81 倍。

3 讨论

全封闭式猪舍气溶胶的微生物组成受诸多因素的影响，猪只生产阶段和环境参数被报道可影响猪舍气溶胶微生物的总菌数和细菌类群分布[6-7]。本试验采用平板培养的方法发现保育舍气溶胶中需氧菌数显著高于其他猪舍，而分娩舍气溶胶中需氧菌数显著低于其他猪舍。前人研究发现，猪舍的环境温度和养殖密度对气溶胶中需氧菌数有着显著的影响，冬季全封闭高温相对于夏季半封闭常温猪舍气溶胶中需氧菌的数量增加10 倍以上[9]，高密度养殖增加了猪舍空气中需氧菌的总数[7]。在养猪生产中，保育舍的环境温度和养殖密度大于其他猪舍，这可能是本试验中保育舍需氧菌数高于其他猪舍的原因。而分娩舍的养殖密度是远远低于其他类型猪舍的，这可能是本试验中分娩舍需氧菌数低于其他猪舍的原因。

表2 猪舍类型对气溶胶中致病菌数量的影响Table 2 Effects of piggery types on pathogens abundances in aerosol log（拷贝数·m-3）

P.Y.Hong 等[7]在18 栋猪舍中气溶胶中检出了大量的弯曲杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、肠球菌和大肠埃希菌，这些致病菌对人类及动物的健康有着巨大的危害。因此，本研究进一步比较了不同猪舍类型气溶胶中上述致病菌的数量。在本研究中，保育舍气溶胶中弯曲杆菌数量显著高于其他猪舍。弯曲杆菌丰度与猪的生产性能负相关，且在未摄入抗生素的仔猪粪便中大量存在[10]。本试验中保育舍气溶胶中最高丰度的弯曲杆菌可能与幼龄动物更易携带该类致病菌有关，但有待进一步研究证实。断奶是猪一生中面临的最大应激事件之一，断奶仔猪易受大肠埃希菌的感染导致腹泻。H.B.Kim 等[8]研究表明断奶仔猪粪便菌群中大肠埃希菌的丰度显著高于其他生长阶段的猪只。与此一致，本研究结果发现，保育舍气溶胶中大肠埃希菌数量显著高于其他猪舍。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，研究表明猪舍内毒素的水平与革兰氏阴性菌特别是大肠埃希菌的丰度显著正相关[4]。本研究发现，保育舍气溶胶中内毒素的水平显著高于其他猪舍，这与其中较高丰度的大肠埃希菌有关。

图2 猪舍类型对气溶胶中内毒素含量的影响Figure 2 Effects of piggery types on endotoxin concentration in aerosol

综上，保育舍中致病菌数量和内毒素水平显著高于其他猪舍，提示保育舍中养猪从业人员和保育猪可能相比其他猪舍有着更大的健康隐患。进一步的研究可以比较不同猪舍类型来源的环境颗粒物对人和动物呼吸道以及全身健康的影响。

4 结论

猪舍类型对气溶胶中致病菌数量和内毒素含量有着显著的影响，保育舍气溶胶中总需氧菌、弯曲杆菌和大肠埃希菌数量以及内毒素含量显著高于其他猪舍。