林麝（Moschus moschiferus）FSHR基因的克隆及进化分析

欧阳菠，张 明，蔡永华，杨 营，郑程莉，程建国，周 明，李 彪， 赟钟 ，徐丰奕，杨建东*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川养麝研究所，成都 610016）

关键字：林麝；FSHR 基因；克隆；进化分析

林麝（Moschus moschiferus）是国家一级保护动物，被列入中国濒危动物红皮书和濒危动植物种国际贸易公约（CITES），在历史上广泛分布于中国的13 个省[1-2]，其中以四川、陕西数量最多[3]。然而，由于人类活动干扰，野生林麝数量从20世纪60年代末的一百多万头锐减至20世纪90年代末的20 万头左右[4]。为了拯救野外濒危的种群，我国自从1958年就着手开展人工养麝繁育研究。目前，人工饲养林麝和活体取香已经取得了一定的成果，林麝的圈养种群规模有所扩大，进而对野外种群的压力起到了一定的缓解作用。尽管人工繁育林麝取得了一定成果，但是圈养种群数量还是有限，而且有关林麝生殖的遗传机制也不清楚。

促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）是调控动物繁殖活动的重要激素之一，是垂体分泌的一种糖蛋白激素，对动物卵巢的生长，发育等起着必不可少的作用[5]。FSH 的生物学信息必须通过位于卵巢卵泡靶细胞上的促卵泡激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）的介导，才能发挥其生物学功能[6]。 FSHR 基因的研究始于Sprengel 等在老鼠中发现FSHR 基因[7]，随后该基因被证明能影响FSH 信号转导，且不同的FSHR 基因的多态性对于卵母细胞形成有显著性影响[8]。 目前，在猪、牛、羊等家畜上已经开展FSHR 基因的相关研究工作，发现基因的第1 和第10 个外显子可以作为繁殖性能和生产性能的标记基因[9-13]。因此，FSHR 基因可以作为常规选育中辅助选择的分子标记，帮助加快育种进程和更加具有目的性的对育种动物进行选育，减少选育优良品种所需要的时间。

然而，迄今为止还未见有关林麝FSHR 基因的研究报道。 因此，本研究拟采用PCR 克隆测序的方法克隆林麝FSHR 基因，并运用进化分析的方法对其核苷酸序列结构及其所编码蛋白序列进行分析，从基因水平上比较不同物种FSHR 基因的差异，为进一步开展FSHR 基因的表达调控、 基因多态性等方面的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验样品采自四川养麝研究所人工繁殖的雌性林麝耳缘组织80 只，样本保存于四川农业大学动物科技学院动物繁殖实验室。

1.2 林麝组织基因组DNA 提取

用灭菌的手术剪剪取40 mg 保存于无水乙醇中的林麝耳缘组织样品，放入1.5 mL 的Eppendorf（EP）管中，尽量剪碎；然后加入800 μL 去离子水（TIANGEN）浸泡10 min，混合摇匀，离心，弃去上清液，重复3 次；加入1×TE 溶液置换2 次，以确保充分去除酒精。经处理后的林麝耳缘组织DNA 提取按照常规酚/氯仿法提取，提取的DNA 用ND-2000 超微量核酸蛋白测定仪（Nanodrop，美国） 检测其浓度。 -80℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

引物设计主要根据NCBI 上已公布FSHR 基因的临近物种家牛（Bos taurus，AC_000168.1）和绵羊（Ovis aries，NC_019460.1）的基因序列，利用primer5.0在基因外显子上下游的保守区域设计特异性引物（表1），送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行合成。

1.4 PCR 扩增及克隆测序

PCR 扩增反应均在PE9700 型PCR 仪上完成。PCR 扩增体系：DNA 模板1.5 μL，正反向引物各0.5 μL，PCR 预混液（成都擎科梓熙生物技术有限公司）22.5 μL，共25 μL。 反应程序为：98 ℃预变性4 min；98 ℃。 变性30 s，复性30 s，72 ℃延伸1 kb/min，共计35 个循环，72 ℃终延伸8 min，4 ℃保存。

所得到的PCR 产物经l.2%琼脂糖凝胶电泳，使用Axygen 凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带，采用pMDl8-T Vector 连接，连接产物转化感受态DH5a，挑取阳性克隆，提取重组质粒，经酶切、PCR 鉴定后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.5 序列分析

序列校对使用Chmmosoma 1.62、DNAStar 7.2等软件。同源相似性及蛋白质的预测采用DNAMAN软件[15]。疏水性分析使用ExpASy protenomics 服务器（https：//www.expasy.org/proteomics）中的protscale 进行预测分析。 采用在线分析软件HNN secondary structure predictionmethod（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html）

对林麝FSHR 基因蛋白的二级结构进行预测。 采用MEGA5.0 软件分析序列特征，计算序列间碱基对的差异信息[15]。 从GenBank 中下载了12 种动物的FSHR基因序列（表2），用MEGA5.0 构建分子进化树，采用的方法为NJ（neighbor-joining）及ME（minimum evolution）法，分支置信度采用自展（Bootstrap）检验法进行评价，自展检验重复次数为1 000 次。

表1 林麝FSHR 各段外显子引物序列Table 1 Exon primer sequences of FSHR fragments in forest musk deer

表2 GenBank 上获取的FSHR 序列信息Table 2 FSHR sequence information obtained on GenBank

2 结果与分析

2.1 测序结果和序列特征

将阳性重组质粒送往成都擎科生物有限公司进行测序，测序结果经过校对，拼接，除去质粒载体及引物序列，得到林麝FSHR 基因序列（登录号为：MG787948）。序列分析显示林麝FSHR 含有10 个外显子，长度为2 088 bp，CDS 区序列长度为1 971 bp，共编码656 个氨基酸残基（图1）。A、T、G、C 的含量分别为25.57%、26.18%、20.70%和27.55%，A+T 含量为51.75%，G+C 含量为48.25%。

2.2 蛋白理化性质分析

对林麝FSHR 蛋白预测分析，发现其分子质量为73.78 kDa，理论等电点（PI）为6.77，在pH=7.0 的条件下的带电荷量-2.27。 疏水性分析结果表明，林麝FSHR 蛋白的氨基酸残基大部分为疏水蛋白残基，其总平均疏水性系数（GRAVY）为0.203。

2.3 FSHR 基因同源性分析

FSHR 基因同源性分析显示，林麝FSHR 基因编码区序列与家牛、印度水牛、藏羚羊、绵羊、白尾鹿、家马、双峰骆驼、单峰骆驼、野猪、家犬、家猫、原鸡的同源性分别为96.1%、95.9%、95.4%、95.3%、95.0%、92.3%、91.3%、91.2%、90.2%、91.2%、90.8%、71.2%（表3）。

2.4 FSHR 基因进化分析

根据所得核苷酸序列，通过NJ（neighbor-joining）法与ME（minimum evolution）法（图2）进行系统进化树的构建，结果显示根据NJ 树构建的进化树，林麝FSHR 基因与家牛、羊、鹿的亲缘关系最近，与原鸡亲缘最远。此外，通过使用ME 法构建的系统发育树结果与NJ 法所构建的进化树一致。

3 讨论与结论

图1 林麝FSHR 基因CDS 序列及由此推导的氨基酸序列Figrue 1 The CDS sequence of the FSHR gene in the musk deer and its deduced amino acid sequence

图2 林麝与其他12 个物种FSHR 基因构建的系统进化树Figure 2 Phylogenetic tree constructed from the musk deer and other 12 species of FSHR genes

繁殖相关功能基因选择在动物育种当中起到了极其重要的作用，可以为动物选育提供重要信息[16-17]。FSHR 基因的结构和功能可以显著的影响FSH 的活性从而对动物的繁殖性能形成显著地影响[18]。 我们的研究表明林麝的FSHR 基因的开放阅读框由10个外显子组成。序列分析表明林麝与牛、绵羊等哺乳动物的FSHR 基因结构基本一致[19-20]。系统发育树显示林麝先与牛科动物合为一支，后与绵羊等相聚合，其结果与前人研究一致[21-22]。整个基因树的拓扑结构也与这12 个物种的生物学分类上的拓扑结构是一致的，这些结果表明FSHR 基因或许可作为系统发生关系研究的有效候选基因之一。 通过对比研究发现，林麝的FSHR 基因及其编码产物的理化性质、序列特征、 蛋白质结构与黄牛，山羊等哺乳动物的FSHR 基因生物信息极为相似[21，23-24]，说明FSHR 基因及其编码产物具有较强的保守性。

目前，在猪、牛、羊等家畜上已经开展FSHR 基因的相关研究工作，发现山羊的FSHR 基因的5’UTR 区多态性与其的产仔数有极显著的关联[10]，小梅山猪FSHR 基因的第1 外显子的多态性与其产仔数具有相关性[9]，牛的FSHR 基因的第10 个外显子与牛的双胎性状具有相关性[25]，但是不同物种上FSHR 对其繁殖性能的影响并不是在同一SNP 位点，正因为如此，FSHR 基因被很多学者当成是影响畜禽繁殖性能的一个重要候选基因展开相关研究，有关林麝繁殖候选功能基因的研究很少，仅王勤等人报道过林麝促卵泡激素和促黄体激素基因的克隆及其序列分析的研究[26]。 本研究通过林麝FSHR 基因的克隆和分析，获得了林麝FSHR 基因序列并预测了其蛋白质氨基酸的部分理化性质及特性，为进一步从分子水平上揭示FSHR 基因在林麝上的作用机制及其影响林麝麝香产量及繁殖性能的机理奠定了基础，扩展了林麝研究的领域，为以后在分子水平上进行林麝选种，提高麝香产量及进一步开展林麝相关功能基因的表达机制的研究提供了一定的参考数据。