女贞子多糖对仔猪抗氧化及MAPK通路的影响

朱 琪，梁世岳，鲁 森，赵 骏，李玉鹏，乔家运,2，李海花

(1.天津大学化工学院，天津 300350；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；3.天津大学理学院化学系，天津 300072； 4.天津中医药大学中药学院，天津 301617；5.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384)

仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌及其内毒素引起的，给中国乃至世界范围内养猪业造成巨大损失[1]。仔猪断奶应激由多种原因引起，其中大肠杆菌病继发感染导致腹泻是仔猪死亡的重要原因，本课题组前期研究发现人工感染大肠杆菌可以引起仔猪氧化损伤，并激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路[2]。饲料中添加女贞子可以提高断奶仔猪生长性能，免疫功能和抗氧化能力[3]。女贞子多糖是女贞子的重要有效成分，具有促进仔猪生长、调节免疫、防病和抗氧化应激等多重功效[4]。本研究通过在饲料中添加女贞子多糖饲喂断奶仔猪，口服大肠杆菌K88攻毒后，检测血清和肝肾组织中的氧化应激相关因子，并评价肝脏组织MAPK信号通路关键蛋白的转录水平，来分析女贞子多糖抗仔猪感染大肠杆菌病的分子机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及分组 选取体重接近(7.93±1.36)kg，(21±2)日龄，健康三元杂交断奶仔猪“杜×长×大”20头。

1.1.2 女贞子多糖的制备 根据水提醇沉法进行女贞子多糖的提取。取200 g炙女贞子于70 ℃烘箱中，3 h后将烘干的女贞子倒入粉碎机粉碎，过40目筛。称40 g女贞子粉放于320 mL蒸馏水中在100 ℃中加热回流2 h，用真空泵抽滤。把分离出的水溶液，用旋转蒸发仪脱除水分浓缩，浓缩到3 g/mL时停止，此时加入一定量乙醇(约67 mL)，使乙醇体积分数占比达到70%，再用玻璃棒进行搅拌15 min后静置6 h。最后真空泵抽滤析出沉淀，抽滤得到的滤饼为女贞子多糖，最后放于烘箱中烘干，称重得4.1 g女贞子多糖，得糖率为10.25%[5]。用此方法共制得200 g女贞子多糖用于后续试验，制备工作在天津大学理学院和天津中医药大学中药学院共同完成。

1.1.3 试验日粮及饲养管理 断奶仔猪20头，每头仔猪为单笼饲养，随机分为4组，每组5头仔猪，标记为对照组、大肠杆菌组、女贞子多糖组和大肠杆菌+女贞子多糖组，。对照组和大肠杆菌组饲喂基础饲粮，女贞子多糖组和大肠杆菌+女贞子多糖组饲喂基础日粮中添加了0.1%的女贞子多糖的饲粮。试验为期15 d，每头仔猪为单笼饲养，自由饮水和采食，湿度为55%～70%，温度为25～28 ℃。在试验进行到第14天时断料不断水，大肠杆菌组和大肠杆菌+女贞子多糖组攻毒大肠杆菌。24 h后所有仔猪进行采血，分离血清进行检测。随后屠宰仔猪采取肝脏和肾脏，用磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗，并迅速放到液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 仔猪大肠杆菌病模型的建立 在饲养第14天时，口服大肠杆菌K88菌液1 mL/kg(菌液浓度为2×109CFU/mL)，菌种为实验室前期保存，具体操作方法参照文献[5]，通过临床诊断，血常规和血清生化指标作为仔猪大肠杆菌病的判定标准，在24 h内记录仔猪的发病情况，24 h后采血剖检采样。

1.2.2 血清及肝、肾氧化指标检测 血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、和过氧化氢酶(CAT)都采用的是比色的方法进行测定，仔猪屠宰后剖检，无菌采集肝脏和肾脏组织，2 h内测定肝脏、肾脏的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，并严格按照试剂盒使用说明进行操作。

1.2.3 引物设计与合成 基因序列的引物是由上海生工工程(北京)技术服务有限公司设计合成。基因名称及引物序列见表1。

表1 氧化应激相关基因引物序列Tab 1 Oxidative stress related gene primer sequences

1.2.4 断奶仔猪肝脏相关基因的检测

综合以上内容，陶瓷与酒的结合在历史上由来已久，对于现代酒类包装设计工作的展开来说，设计人员必须能在确保陶瓷这一传统文化元素发挥出自身作用的同时，保证酒类产品外包装设计的创新性。

1.2.4.1 总RNA的提取和反转录 样品处理：首先称重研磨管并记录，采取各组肝脏分别放于研磨管中，称重记录。RNA提取：使用DNA/RNA Extraction Kit(金瑞鸿捷生物科技有限公司)试剂盒进行提取。反转录：使用All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(广州易锦生物技术有限公司)试剂盒。

1.2.4.2 实时荧光定量PCR 使用All-in-OneTMqPCR Mix(广州易锦生物技术有限公司)试剂盒，加样、离心、振荡、离心，然后把8连管放入到荧光定量PCR仪中。反应程序为：预变性95 ℃，10 min；40个循环；溶解曲线分析。

1.3 统计分析 Excel2013对试验数据进行初步整理，采用SPSS20.0分析软件进行单因素方差统计分析，数据用平均值±标准差表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准，以P<0.01作为差异极显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 女贞子多糖对感染大肠杆菌仔猪血清抗氧化指标的影响 由表2可知，试验Ⅰ组仔猪血清MDA含量显著高于对照组(P<0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)含量显著低于对照组(P<0.05)。试验Ⅰ组仔猪血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量与试验Ⅲ组无显著差异(P>0.05)，且试验Ⅱ与试验Ⅰ组亦无显著差异(P>0.05)。对照组仔猪血清过氧化氢酶(CAT)含量显著高于其余各组(P<0.05)，且其余各组间无显著差异(P<0.05)。

2.2 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪肝、肾抗氧化指标的影响 由表3可知，肝脏MDA含量大肠杆菌组最高，和其它三组比较差异极显著(P<0.01)，SOD含量大肠杆菌组最低，比对照降低了57.86%，差异极显著(P<0.01)；肾脏MDA含量各组差异不显著(P>0.05)，SOD含量大肠杆菌组比对照组下降了58.21%，差异极显著(P<0.01)。

2.3 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪肝脏氧化应激相关基因表达的影响 由表4可知，肝脏CAT基因转录水平：大肠杆菌组显著高于对照组和大肠杆菌+女贞子多糖组(P<0.05)，与女贞子多糖组差异不显著(P>0.05)；锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和锌铜超氧化物歧化酶(CuZnSOD)各组变化趋势基本一致；谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)：大肠杆菌组显著高于其它各组(P<0.05)；谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)各组差异不显著(P>0.05)。

表2 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪血清抗氧化指标的影响Tab 2 Effects of ligustrum polysaccharide on serum antioxidant indexes of weaned piglets

同行数据相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)

表3 女贞子多糖对断奶仔猪感染大肠杆菌肝肾抗氧化能力的影响Tab 3 Effects of ligustrum polysaccharide on liver and kidney antioxidant capacity of weaned piglets infected with E.coli

同行数据相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)

表4 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪肝脏的氧化应激相关基因mRNA表达的影响Tab 4 Effects of ligustrum polysaccharide on mRNA expression of oxidative stress related genes in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行数据相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)

2.4 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪炎症介质与细胞内分子相关基因表达的影响 由表5可知，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)各组均高于对照组且差异极显著(P<0.01)；热休克蛋白70(HSP70)各组均高于对照组且差异极显著(P<0.01)；环氧酶2(COX2)各组差异不显著(P>0.05)。

表5 女贞子多糖对断奶仔猪感染大肠杆菌炎症介质与细胞内分子相关基因表达的影响Tab 5 Effects of ligustrum polysaccharide on the expression of intracellular molecule-related genes and inflammatory mediators of weaned piglets infected with E.coli

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表6 女贞子多糖对感染大肠杆菌断奶仔猪肝组织MAPK相关基因表达的影响Tab 6 Effects of ligustrum polysaccharide on MAPK-related gene expression in liver of weaned piglets infected with E.coli

同行数据相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，大写字母表示差异极显著(P<0.01)

3 讨论与结论

3.1 女贞子多糖对大肠杆菌诱导断奶仔猪氧化应激的保护作用 大肠杆菌可以引起断奶仔猪应激，产生大量自由基，进而导致仔猪机体的氧化损伤[6]。通过一系列的脂质过氧化反应最终产生MDA，其含量的高低能够间接反应自由基产生的多少，也可以体现脂质过氧化在畜禽机体组织细胞内的反应程度。SOD和GSH广泛的存在动物机体的组织中，可以使超氧阴离子O2-转化为H2O2进而被清除，它含量的高低能够反映出动物机体清除自由基的能力[7]。动物机体内的CAT是防御体系非常重要的酶，能够将过氧化氢(H2O2)转化为分子氧和水。

前期研究发现，女贞子萃取物可以有效降低仔猪血清和肌肉中的MDA含量，提高肝脏SOD和血清GSH-Px水平。植物多糖可以显著提高断奶仔猪血清总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性和总抗氧化能力，降低血清和组织中的MDA含量[8]。研究发现，女贞子多糖可以显著降低由大肠杆菌引起的仔猪血清MDA含量的升高，对大肠杆菌引起的抗氧化酶下调有缓解作用，但对正常对照组仔猪无显著影响，揭示出女贞子多糖对仔猪的调节保护作用。本课题组前期研究表明仔猪人工感染大肠杆菌后，血清生化指标显示肝、肾功能异常，研究选取肝、肾组织两个关键氧化指标MDA和SOD作为参数[7]。从结果来看女贞子多糖可以通过调节肝肾组织中MDA和SOD的水平，起到保护肝肾的目的，这与前期的研究相一致。

3.2 女贞子多糖对大肠杆菌仔猪肝脏氧化应激相关转录因子和MAPK信号的调控 GPX1、GPX4是GSH-Px家族的同工酶，它能够使细胞避免氧化攻击、抵抗脂质过氧化反应和清除动物机体内的氧自由基。GPX4在机体内对磷脂氢过氧化物有比较高的活性，与VE结合能够起到抗氧化的作用，并且能够还原磷脂，使动物机体的细胞避免脂质过氧化。

研究发现，断奶仔猪感染大肠杆菌后，肝脏GPX1基因转录水平有所升高，预示肝组织将产生更多的GSH-Px酶抵御氧化应激。

CuZnSOD能够将超氧阴离子的自由基转移性清除，在维持动物机体内的氧自由基相对平衡能够起到十分重要的作用。在动物发生氧化应激的时候MnSOD有着非常迅速的反应性，以及它在细胞的线粒体中能够将超氧化物转化为氧分子和H2O2，进而把机体内有害的ROS清除。与CAT相关的基因能够调节机体内过氧化氢酶的分泌与合成，CAT在机体内能够将H2O2转化成水和分子氧，进而使H2O2得到清除，使机体免受过氧化的伤害。研究发现，当仔猪感染大肠杆菌后，女贞子多糖可以提高仔猪肝脏中CAT和CuZnSOD转录水平，从而清除体内过量的氧自由基。

COX2和TNF-α是动物体内非常重要的急性炎症因子，正常情况下表达量很少或者不表达，机体在发生炎症后，COX2和TNF-α的表达量会大幅增加。HSP在细胞内能够起到保护作用，在动物机体细胞当中能够找到高效的HSP70，它能够缓解机体发生的炎症反应，并且对肝脏的再生起到促进作用。有研究证实，动物机体细胞内的HSP70能够与NF-κB相互反应，避免NF-κB在动物机体内活化[9]。实验表明仔猪感染大肠杆菌后，肝脏COX2基因表达量相对不变，而TNF-α的表达量极显著升高；女贞子多糖前处理后，TNF-α的表达量变化不显著，但攻毒大肠杆菌后TNF-α的表达量极显著降低。这说明在正常情况下，女贞子多糖对仔猪肝脏TNF-α的转录表达无影响，但可以降低大肠杆菌攻毒后的转录表达，提示女贞子多糖对肝组织的保护机理与抑制急性炎症因子相关。

MAPK是一种丝氨酸蛋白激酶或者是一种苏氨酸蛋白激酶，能够感受上游受体传来的信号，并且能够将信号传导到相应的细胞核当中，能够调节基因的表达以及细胞的增殖和凋亡。MAPK由三种重要的蛋白激酶组成,ERK对细胞能够起到保护的作用，而P38和JNK对细胞起到促进凋亡的作用[10]。MAPK信号通路当中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是一条比较成熟的通路，它能够将细胞膜的受体所接受信号转移到细胞核内，进而细胞内相应蛋白得到了表达，它可以调节细胞的自噬、凋亡、分化和增殖等重要功能[11-12]。研究表明抑制ERK信号通路之后，可以缓解氧化损伤对细胞的损害，与之相反，激活ERK信号通路能够对细胞起到损伤的作用。本试验通过研究发现仔猪肝脏mRNA转录水平ERK1的大肠杆菌+女贞子多糖组与大肠杆菌组相比降低且差异极显著，而女贞子多糖组与对照组相比差异不显著，说明女贞子多糖对断奶仔猪感染大肠杆菌起到了保护作用，且对正常仔猪没有不良影响，但P38和JNK基因表达相对较低，与上述研究一致。

3.3 结论 女贞子多糖可以通过调节肝脏抗氧化指标保护大肠杆菌引起的仔猪氧化应激反应，其作用机制可能与下调MAPK相关信号转录水平有关，从而揭示女贞子保护仔猪肝脏的分子机理。