埃博拉病毒分子生物学研究进展

孙英尧，董 浩

(吉林农业大学生命科学学院，长春 130118)

埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)是一种十分罕见的病毒，它是在1976年同时暴发的两起疫情中首次出现的，一起在现在的南苏丹恩扎拉，另一起在刚果民主共和国扬布库。后者发生在位于埃博拉河附近的一处村庄，该病由此得名。感染埃博拉出血热(Ebola virus disease, EVD)通常潜伏期为4～10 d，初期症状与流感类似，表现为呕吐与腹泻，随后身体内外出血，伴随有突发休克，最后是多器官衰竭。病人一般在出现症状后的6～16 d死亡。尽管目前已研发了一些疫苗可对埃博拉病毒进行防护，但我们对埃博拉病毒的了解还不够。本文就埃博拉病毒的分子生物学研究进展作一综述，以期为更深入的研究提供参考。

1 埃博拉病毒的分类学地位

埃博拉病毒属于单股反意病毒目(Mononegavirales)丝状病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒属(Ebolavirus)。该属又包含5个种：本迪布焦埃博拉病毒(BundibugyoEbolavirus，BEBOV)、雷斯顿埃博拉病毒(RestonEbolavirus，REBOV)、苏丹埃博拉病毒(SudanEbolavirus，SEBOV)、大森林型埃博拉病毒(TaiForestEbolavirus；IvoryCoastEbolavirus，ICEBOV)、扎伊尔型埃博拉病毒(ZaireEbolavirus，ZEBOV)。丝状病毒科下还有两个属，为马尔堡病毒(Marburgvirus，MAEV)与奎瓦病毒(Cuevavirus)[1]。

2 埃博拉病毒分子生物学研究进展

埃博拉病毒(图1)直径80 nm，长度为970～1200 nm，进入细胞后病毒的长度可达14000 nm[2]。埃博拉病毒的反意基因长达19 kb，基因组呈线状，无分段，包含有7个基因与两个调节区段。两个调节区段位于3’头端与5’尾端。3’头端有双向复制的启动子，也是第一个基因的转录起始位点。5’尾端编码复制启动子的互补序列[3]。7个基因分别对应编码埃博拉病毒的7种病毒蛋白，分别为：核蛋白(nucleoprotein，NP)、糖蛋白(glycoprotein，GP)、L聚合酶蛋白(L-polymerase protein，L)、病毒蛋白24(viral protein24，VP24)、病毒蛋白30(viral protein30，VP30)、病毒蛋白35(viral protein35，VP35)与病毒蛋白40(viral protein40，VP40)[4]。7种蛋白的分子生物学特征综述如下：

图1 埃博拉病毒电镜照片[5]Fig 1 Electron microscope photography of Ebola virus[5]

2.1 病毒蛋白24(VP24) VP24是丝状病毒的常见蛋白。以往的研究表明，该蛋白的功能是抑制宿主机体产生α、β与γ干扰素，阻碍干扰素基因的翻译过程。VP24能够通过结合真核细胞核孔的核转运蛋白以及抑制KappaB(NF-KB)通路来阻止编码干扰素基因的转录、信号转导与磷酸化过程[6]。

VP24也是病毒组装衣壳的重要蛋白，它增强了不同结构蛋白之间的协同催化作用。通过观察C、N末端缺失的VP24，发现N末端编码的VP24具有调控衣壳蛋白形成的作用[7]，说明VP24在病毒衣壳合成过程中起的作用应该为催化作用或者为调控VP35与NP。另有研究表明，VP24与VP40的共同表达能够形成大量的类病毒粒子(VLPs)，远比VP40单独表达时多得多，推测可能是VP24的小干扰RNA(siRNA)降低了病毒的释放量，使大量的病毒蛋白保留在被感染的细胞内。此外还有研究表明，VP24结合在VP35的病毒衣壳外表面，起到了调节NP层、增强衣壳机械强度稳定性的作用，增强了NP、VP35、VP24的协同关系[8]。

2.2 病毒蛋白35(VP35) VP35的主要作用是影响宿主的免疫系统，使病毒免于被宿主的免疫机制清除。VP35是1型干扰素的拮抗物，通过与双链RNA结合抑制干扰素调节因子3，同时抑制1型干扰素RIG-1的信号传导从而降低α型与β型干扰素的生成[9]。VP35还能通过多种途径影响宿主整体的免疫系统。VP35通过增加活跃的STAT1(转录活化蛋白1)调节干扰素调节因子7的活性，抑制干扰素生成toll样受体与RIG-1的活性。已有证据表明，VP35还可以解除RNA沉默，可以使先天免疫信号传导与宿主的抗病毒反应失效[10]。

此外，VP35也有协助病毒复制的功能。VP35的C末端可以结合双链RNA，而N末端可以结合NP。当VP35的N末端与NP解离时，NP会活化，随后与病毒RNA结合，高度激活基因组的转录活性，随后的NP解离，并出现寡聚现象，形成寡聚NP。但NP单体并没有寡聚的倾向，仅在上述的生化反应中才会出现寡聚。此外，其他病毒中VP35与NP的作用反而会降低NP的寡聚化。对这一现象的研究可能是研发治疗埃博拉出血热的突破口。

2.3 病毒蛋白30(VP30) VP30是埃博拉病毒的一种次要核蛋白质，主要作用是起始病毒基因组的转录，并调节细胞的动态磷酸化过程[11]。最新的报道发现，VP30还具有解除RNA干扰的功能，但是具体机制尚不明确。当存在siRNA时，VP30会影响主要参与RNA干扰的蛋白的帽子结构，这时即使是VP35的N末端RNA结合域已经结合，但VP30的干涉仍会启动。这表明VP30蛋白的RNA结合功能非常广泛，而且不止限定于宿主或者病毒自身的RNA，似乎存在一定的碱基结构选择性，但是这一功能是否为病毒RNA转录所必须的，目前尚不可知。

2.4 病毒蛋白40(VP40) VP40是病毒组装的基石[12]，其主要作用是形成六聚物——这一结构被认为是埃博拉病毒衣壳的基础结构，功能为埃博拉基因组复制与RNA的结合[13]。

以往的研究多针对于该蛋白作用调节生成VLPs，而最近的研究表明，VP40还可以产生外泌体结构，杀死免疫细胞。外泌体的出现一般是在病毒感染细胞之后， VP40导致的外泌体接触到未成熟的T细胞和单核白血球细胞后，会引起这两者的凋亡及活性下降。关于VP40在致病机制中的作用，有可能是开发新治疗手段的切入点。已有研究用酪氨酸磷酸激酶对其进行酪氨酸残基加聚磷酸基团，降低VP40的活性。还有使用氧四环素作为其他治疗手段[4]，它可以导致VP40相关的分泌小体减少，并显著降低接受了分泌小体的受体细胞的生存能力，这一成果对治疗埃博拉出血热有着很大的研发空间。

2.5 糖蛋白(GP) GP是埃博拉病毒蛋白中最主要的毒性蛋白。GP并非指单独的GP糖蛋白，而是由编码GP基因经过转录编辑形成的三种产物的总称：其包括全长的GP蛋白(包含GP1受体结合域，GP2病毒融合域两个亚基)；可溶性GP(sGP，缺少横跨膜域)与小可溶GP(ssGP)。sGP上存在福林酶位点，经过福林酶处理后的sGP可以产生一个碎片片段称为△-肽[14]。

GP与病毒感染细胞的途径密切相关。通过GP介导的胞饮作用，GP会将病毒与宿主细胞的前溶酶体结构相融合，促使病毒进入细胞。在毒性方面，GP通过黏蛋白类似域影响细胞的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，降低了ERK2的磷酸化作用与催化活性，降低宿主细胞的粘附性，使细胞剥离且不能维持正常的球形，继而使细胞死亡[15]。此外，sGP的碎片产物△-肽有可能还扮演着埃博拉病毒致病机理中病毒孔蛋白的作用，其可以在哺乳动物的原生质膜上形成孔道，增加离子通透性，破坏细胞的内环境平衡[16]。

GP作为位于病毒衣壳表面的蛋白，与埃博拉病毒的侵染选择性也有很深的渊源。在2014-2016年的西非埃博拉出血热爆发中，检测到的埃博拉病毒的GP蛋白在A82V中的高频变异。这一变异增加了GP的膜融合活性，并且使得大量其他型的细胞变得可以被侵染：包括黑猩猩的纤维母细胞(S008842)、恒河猴上皮细胞(FRhK4)、非洲绿猴上皮细胞(Vero)以及人树突细胞。这一信息表明新种埃博拉病毒已经开始高度适应人类作为宿主[17-18]。

2.6 核蛋白(NP) NP是埃博拉病毒的复制循环中的重要蛋白——核糖核蛋白复合物的亚基，其主要功能是保护病毒RNA免于被降解，保证病毒基因组在装配过程中正确进入到病毒粒子的衣壳中。目前NP的新功能并没有发现。

2.7 聚合酶蛋白(L) L是依赖RNA的RNA聚合酶，是病毒多聚酶复合物的元件之一。主要功能是病毒的转录与复制过程中对病毒RNA进行反转录与翻译，但是L作为一种病毒的RNA聚合酶，其功能与真核细胞的RNA聚合酶差异很大。以GP基因为例子，L将其翻译的结果是sGP而不是GP[19]。L的翻译也是实现调节GP、sGP、ssGP不同水平的原因。在连续培养的组织细胞中，L被发现能够在GP基因中连续的7个U中再添加一个U，从而调节GP与sGP的表达比率为80∶20。在豚鼠的实验中，该基因回复突变再次使这个基因又变回了7个U，导致GP∶sGP=20∶80[20]。这一特点有可能是病毒进行免疫回避的一种独特手段。作为对比，在人的肝癌细胞系(Hun7)中的病毒复制则是一个该基因为9U的变异体，其保持了高水平的sGP表达，同时增强的还有ssGP的表达。通过豚鼠与人肝癌细胞的两个实验中不难发现L除了翻译的功能之外，还存在有调节GP与GP相关蛋白比例的功能。这一现象据推测可能与病毒为了适应不同的宿主而进行的调节有关，从而实现在宿主体内的快速复制。

3 结 语

埃博拉出血热目前尚无有效的治疗手段。对埃博拉疫苗的研究始于2004年，由美国卫生与公众服务部(State Department of Health and Human Services)发起的Project Bioshield，最终于2014年推出了能够100%保护的疫苗，这为后来的埃博拉病毒疫苗提供了模板。随后的口腔炎病毒(rVSV)与扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)糖蛋白的重组病毒(rVSV-ZEBOV)疫苗在2016年的埃博拉疫情中效果显著，但是仍然有患者在痊愈后1～2年中抗体显著下降，有着复发的潜在危险[21]。目前来看，针对于埃博拉出血热的疫苗开发形式仍然严峻。