双重保留机理下液相色谱-质谱法直接分析18种氨基酸

杨茜 肖炳坤 杨建云 黄荣清

摘 要 采用反相和阳离子交换双重保留机理， 无需添加离子对和衍生化试剂， 建立了18种游离氨基酸的液相色谱-质谱联用直接分析方法。采用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（HPLC-MS/MS）系统， 使用OSAKA SODA CAPCELL PAK CR 1∶4 （150 mm × 2.1 mm， 5 μm; SCX∶C18=1∶4）色谱柱， 以0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸铵（C）为流动相进行三元梯度洗脱， 对18种氨基酸进行分离检测， 可得到良好的分析结果。色谱峰面积精密度（RSD）范围为0.7%～5.9%; 标准曲线线性关系良好（R2=0.993～0.999）; 对SD大鼠血清和尿液样品加样回收率范围为92.2%～113.6%。本方法流动相条件简单， 灵敏度高， 可用于血清和尿液中游离氨基酸分析， 为生物样品中氨基酸检测或其它复杂基质中氨基酸的检测提供了新的方法和思路。

关键词 高效液相色谱-串联质谱法; 氨基酸分析; 非衍生化生物样品; 双重保留机理

1 引 言

氨基酸是构成蛋白质的基础， 是生命活动中不可或缺的一类小分子物质。对生物体内氨基酸的分析研究， 有助于了解生命过程， 对于疾病的诊断[1，2]和药物的研究[3，4]具有重要作用。

氨基酸的分离检测技术一直是研究者的关注点之一， 尽管氨基酸分析方法多种多样， 但改进现有方法， 使其具有更好的专属性与灵敏度一直是研究的热点和难点问题[5]。现有分离方法包括毛细管电泳法、 气相色谱法、液相色谱法等， 氨基酸分离后再通过荧光、紫外、蒸发光散射、质谱等检测器进行检测。其中， 液相色谱是一种常用分离手段。在氨基酸的液相分离中， 由于氨基酸类物质含有氨基和羧基两种官能团， 一方面自身极性很强， 难以直接在反相C18色谱柱上得到良好保留， 另一方面紫外吸收弱， 生命体中常见的20种氨基酸中， 除酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸外， 均难以在紫外检测器（UV）上得到高灵敏响应。为了改善氨基酸的保留与检测问题， 通常使用衍生化试剂在柱前或柱后对氨基酸进行衍生。从最初的茚三酮比色分析[6]方法， 到现阶段常用的邻苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）、异硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化试剂， 均能很好地改善氨基酸在液相色谱分析中保留差、吸收弱的缺点， 建立在线或离线的液相色谱分析方法[7～12]。但衍生化试剂的引入， 对衍生环境条件及氨基酸结构要求高， 如OPA只对一级氨基酸具有衍生作用， Dansyl-Cl、PITC衍生速度慢， 操作方法繁琐， 相对重现性较差[13～16]。对于生物样品分析， 衍生化试剂的引入会将原本就复杂的体系进一步复杂化， 增加解析的难度。

近年来， 质谱技术的高速发展在一定程度上满足了氨基酸高灵敏检测的需求。氨基酸容易离子化， 在电喷雾源（ESI）正离子模式下能够得到很好的响应[17]， 同时由于质谱检测的信号为质荷比（m/z）， 即使未能达到基线分离的情况， 也可通过不同质荷比进行定量分析[18]， 因此在氨基酸的液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析中， 氨基酸在色谱柱上的保留成为关键。目前， 氨基酸的LC-MS分析方法多通过衍生化或添加离子对试剂改善其保留行为， 如在流动相中添加七氟丁酸、九氟戊酸等挥发性离子对试剂[19]， 但该类物质的加入又会在一定程度上影响质谱离子源的离子化[20]。为了改善氨基酸在LC-MS上的保留问题， 诸多新机理的色谱柱被应用， 如使用石墨化碳（Hypercarb）柱可将氨基酸由酸性至碱性顺序洗脱[21，22]; 使用亲水性相互作用（HILIC）柱可将极性氨基酸良好保留[23]等。双重机理色谱同样也可作为氨基酸分析的全新分离保留手段[24]， Choi等[25]利用固定相中嵌入亲水性和阳离子交换配体的混合型柱对尿液中的氨基酸进行了分析。本研究引入阳离子交换和反相作用双重机理， 通过阳离子交换作用对氨基酸的氨基部分进行保留， 同时通过反相作用对疏水性差异进行识别， 增强分离能力。最终在LC-MS上仅使用甲酸-乙腈-甲酸铵的简单分析体系， 无需衍生化和添加离子对试剂， 实现了18种氨基酸的高灵敏定量分析， 并采用此方法测定了SD大鼠血清和尿液中的氨基酸含量。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Nanospace 高效液相色谱仪系统， 配备脱气机， 二元高压泵， 高压单泵， 高精度自动进样器NASCA， 柱温箱（日本Osaka Soda公司）; QTRAP 5500 三重串联四极杆质谱仪（美国SCIEX公司）; ML204/02万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）; Fungilab超聲波仪（西班牙Fungilab公司）; Centrifuge H-501FR离心机（日本Kokusan公司）; Milli-Q UltrapUre Ion-Ex-TM超纯水机（美国Millipore公司）。

乙腈、甲酸、甲酸铵（色谱纯， 北京百灵威公司）; 18种氨基酸标准品：甘氨酸（批号140689-201605）、丙氨酸（批号140680-201604）、脯氨酸（批号140677-201507）、缬氨酸（批号140681-200401）、苏氨酸（批号140682-201302）、亮氨酸（批号140687-201503）、异亮氨酸（批号140683-201302）、组氨酸（批号140693-201803）、苯丙氨酸（批号140676-201706）、精氨酸（批号140685-201003）、酪氨酸（批号140609-201513）购于中国药品生物制品检定所; 丝氨酸（批号20121017）天冬氨酸（批号20130717）、天冬酰胺（批号20130308）、赖氨酸（批号20131104）、谷氨酸（批号20130717）、甲硫氨酸（批号20130702）和色氨酸（批号20130418）购于国药集团化学试剂有限公司。实验用水为Milli-Q系统制备的超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱条件 采用CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）色谱柱（日本Osaka Soda公司）， 流动相为0.1%甲酸（A）-乙腈（含0.1%甲酸）（B）-50 mmol/L甲酸铵（C）， 采用梯度洗脱： 0～3.0 min， 100% A， 0.2 mL/min; 3.0～10.0 min， 100%～30% A， 0%～70% B， 0.2～0.3 mL/min; 10.0～15.0 min， 0%～100% C， 0.3 mL/min; 15.0～20.0 min， 100% C， 0.3 mL/min; 20.0～20.1 min， 0%～100% A， 0.3 mL/min; 20.1～30.0 min， 100% A， 0.3 mL/min。柱温35℃， 进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 Turbo-V电喷雾离子源， 采用正离子模式检测， 喷雾电压5500 V， 离子源温度400℃， 喷雾气体（GAS1）20 psi， 干燥气体（GAS2）20 psi， 气帘气（Curtain GAS）20 psi。采用多反应监测（MRM）模式， 入口电压（EP）10 V， 碰撞室出口电压（CXP）10 V， 各个物质母离子、子离子、去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）等参数见表1。

2.2.3 样品制备  （1）混合对照品溶液的制备 分别称取甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸标准品， 精密称定后， 酪氨酸和天冬氨酸使用0.1% （V/V）氨水溶解， 苯丙氨酸使用50% （V/V）乙腈溶解， 其余氨基酸均使用超纯水溶解， 制成对照品储备液。分别移取适量对照品储备液， 加流动相A稀释成混合对照品溶液（甘氨酸3.08 μg/mL、丙氨酸0.5 μg/mL、丝氨酸0.6 μg/mL、脯氨酸0.1 μg/mL、缬氨酸0.15 μg/mL、苏氨酸0.8 μg/mL、亮氨酸0.145 μg/mL、异亮氨酸0.145 μg/mL、天冬氨酸0.115 μg/mL、天冬酰胺0.9 μg/mL、赖氨酸0.2 μg/mL、谷氨酸0.7 μg/mL、甲硫氨酸0.550 μg/mL、组氨酸0.275 μg/mL、苯丙氨酸0.140 μg/mL、精氨酸0.7 μg/mL、酪氨酸0.2 μg/mL、色氨酸0.375 μg/mL）， 摇匀， 备用。（2）实验动物 雄性SD大鼠6只， 饲养室光照12 h， 黑暗12 h， 模拟正常环境， 室温（25±2）℃， 相对湿度35%～45%。适应性饲养3天后， 常规饲料饲养一周， 自由饮水， 置于代谢笼中收集12 h尿液后， 第二日腹主动脉取血， 12000 r/min离心后获得血清。（3）血清样品前处理 取血清50 μL， 加入200 μL超纯水， 振荡30 s后超声10 min， 取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振荡并超声， 12000 r/min离心15 min， 上清液过0.22 μm滤膜， 用流动相A稀释10倍， 待上样分析。（4）尿液样品前处理 取200 μL尿液， 12000 r/min离心5 min， 取50 μL上清液， 加入200 μL超纯水， 振荡30 s后超声10 min。取50 μL， 加入200 μL乙腈沉淀蛋白， 再次振荡并超声， 12000 r/min离心15 min， 上清液过0.22 μm滤膜， 使用流动相A稀释10倍， 待上样分析。

3 结果与讨论

3.1 保留模式的选择

为了实现氨基酸类物质在液相色谱柱上的良好保留， 考察了不同机理色谱柱的保留能力。首先使用反相模式C18色谱柱（CAPCELL PAK C18 MGIII 150 mm × 2.1 mm， 5 μm）进行分析， 3 min内以0.1%甲酸进行反相保留， 在随后的12min逐渐添加有机相乙腈至80%比例，结果发现除甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以外的氨基酸保留时间均不足2min， 出峰均在死时间附近， 因此使用反相色谱柱在不衍生、不添加离子对试剂的情况下， 无法将大多数氨基酸良好保留。

氨基酸为两性化合物， 通过调整pH值可使其带正电荷或负电荷， 因此可使用离子交换模式进行保留。本研究考察了直接使用阳离子交换型SCX（CAPCELL PAK SCX 150 mm×2.1 mm， 5 μm）色谱柱进行分析的效果。在阳离子交换机理下， 反相机理中无法保留的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、賴氨酸、谷氨酸得到保留， 但出峰时间均较为接近， 碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸和色氨酸）由于保留过强， 在50 mmol/L甲酸铵缓冲盐条件下无法洗脱。因此， 考虑将反相和阳离子交换机理相结合， 通过一定的阳离子交换作用实现氨基酸的保留， 同时在反相机理的参与下也更有利于氨基酸分离与洗脱。色谱柱选择混合填料型（混合比SCX∶C18=1∶4）的CAPCELL PAK CR 1∶4（150 mm×2.1 mm， 5 μm）与键合型（硅胶球孔内键合反相和阴离子交换特性的固定相， 硅胶球间键合阳离子交换的固定相）Acclaim Trinity P1（100 mm×3.0  mm， 5 μm）两种同时具有离子交换与反相作用的色谱柱进行比较分析。在离子交换和反相双重机理作用下， CR或P1色谱柱对极性氨基酸的保留时间均延长至3 min以上， 双重机理CR色谱柱和反相C18色谱柱的保留时间对比见表2， 在双重机理模式作用下， C18色谱柱无法保留的天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸等氨基酸均获得了良好保留， 实现了氨基酸的非衍生化法直接保留。由于P1色谱柱对精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸峰型拖尾， 峰宽超过2 min， 最终选择CR色谱柱进行了分析方法建立。

3.2 流动相的选择和梯度条件优化

在双重保留机理色谱柱上， 对于反相疏水作用使用乙腈（B）为洗脱溶剂， 对于离子交换作用使用甲酸铵（C）作为洗脱溶剂， 在三元梯度条件下进行方法建立。考察甲酸铵浓度在10、25和50 mmol/L时的洗脱效果， 结果表明， 使用10和25 mmol/L甲酸铵， 无法将组氨酸和精氨酸洗脱， 因此最终选择使用50 mmol/L甲酸铵作为洗脱溶剂。x3.3 回收率及提取条件优化

对血清和尿液样品添加标准品后（添加浓度： 甘氨酸3.0 μg/mL、丙氨酸50.0 μg/mL、丝氨酸60.0 μg/mL、 脯氨酸10.0 μg/mL、缬氨酸15.0 μg/mL、苏氨酸80.0 μg/mL、亮氨酸14.5 μg/mL、异亮氨酸14.5 μg/mL、天冬氨酸11.5 μg/mL、天冬酰胺9.0 μg/mL、赖氨酸20.0 μg/mL、谷氨酸7.0 μg/mL、甲硫氨酸5.5 μg/mL、組氨酸27.5 μg/mL、苯丙氨酸14.0 μg/mL、精氨酸70.0 μg/mL、酪氨酸20.0 μg/mL、色氨酸37.5 μg/mL）， 按照2.2.3节方法进行前处理， 血清样品加样回收率为92.2%～113.6%; 尿液样品加样回收率为95.2%～109.3%。

在加标回收实验中发现， 若直接使用乙腈沉淀血清和尿液中的蛋白， 会导致溶解度低的氨基酸回收率较差， 如谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸用此方法的回收率约为80%。为了避免前处理过程中可能的氨基酸损失， 优化了前处理方案， 采取先加4倍量水到血清（尿液）中进行稀释并提取氨基酸后， 再加入乙腈沉淀蛋白。通过改善前处理方法， 血清的加标回收率由76.1%～96.9%上升至92.2%～113.6%， 尿液加标回收率由75.5%～101.6%上升至95.2%～109.3%。

3.4 线性范围、定量限和精密度

4 结 论

使用反相和离子交换双重机理型色谱柱， 在不衍生化、不添加离子对试剂的简单条件下， 实现了18种氨基酸的LC-MS/MS分离和定量测定。本方法操作简单， 灵敏度高， 虽然目前尚未将同分异构体氨基酸良好分离（如亮氨酸和异亮氨酸）， 但此方法为生物样品中氨基酸检测或其它复杂基质中游离氨基酸的检测提供了新的方法和思路。

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