寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用

邹雪梅 周佳伟 宋尚红 陈冠华

摘 要 适配体是一类从随机寡核苷酸文库中筛选出来的可对特定靶分子具有高亲和性和特异识别性的单链短脱氧核糖核酸或核糖核酸序列。自从指数富集配体系统进化（SELEX）的筛选方法问世以来，相继出现了各种基于SELEX的改进筛选方法，以及基于毛细管电泳分离手段的SELEX或非SELEX筛选方法。作为类似于抗体作用的分子识别元件，适配体在与食品和环境安全相关的农兽药残留检测领域中已得到一定的应用。在这些应用中，适配体通常与其它可以产生信号的材料如纳米金、量子点等构成复合探针，或与电化学电极等构成传感器。本文对适配体的筛选方法以及适配体在农兽药残留检测中的应用进行了概括和总结，以期为该研究提供有益的参考。

关键词 适配体; 筛选; 农兽药残留; 检测; 评述

1 引 言

食品安全和環境问题被发达国家和许多发展中国家高度重视，各国制定了严格的强制性法规来强化对包括农兽药残留在内的各种有害物质的监管。例如，美国规定在牛奶中不可检测出抗生素残留，欧盟限定了鸡蛋中四环素类抗生素的最大残留限量（MRL）为200 μg/kg。因此，对食品和环境样品中农兽药残留进行有效快速检测始终是相应领域的重要研究课题。

适配体是一类从人工构建的随机寡核苷酸文库中筛选出来的单链短脱氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA）序列，通常由20～80个碱基组成，库中寡核苷酸序列数可达1013～1015个。适配体可以与靶分子高特异性、高亲和性结合，适配体与各类靶分子的解离常数可低至nmol/L～pmol/L水平，而高特异性则体现为适配体可以区分仅有一个甲基区别的两种靶分子，可被适配体识别的靶分子范围十分广泛，大的分子或者颗粒等包括疟疾诊断蛋白恶性疟原虫乳酸脱氢酶（PFLDH）[1]、穿孔素蛋白[2]等蛋白质，甚至是产肠毒性大肠杆菌k88[3]、金黄色葡萄球菌[4]等微生物，以及HepG2肝癌细胞[5]、AGS胃癌细胞[6]等细胞，小分子可包括一般意义上的各种小分子化合物，如双酚A[7]、L-色氨酸[8]、黄曲霉毒素[9]等。作为一种高特异性和高亲和性的分子识别元件，适配体在农兽药残留的定性与定量快速检测中得到了一些应用，展现了极为广阔的应用前景。如何将特定靶分子的适配体从庞大的随机寡核苷酸文库中筛选出来，研究者也进行了广泛和深入研究。本文对适配体筛选方法和适配体在农兽药残留检测中的应用研究进行了整理和概述，为其进一步的应用提供一些有用的参考。

2 适配体的筛选

序列数庞大的随机寡核苷酸文库为筛选对各种靶标具有高特异性识别能力和高亲和性的适配体提供了基本条件，然而从序列数量达到1013～1015个的随机文库中将特定靶标的适配体筛选出来绝非易事。文献[10，11]分别提出了指数富集配体系统进化（SELEX）的筛选方法，解决了适配体的筛选问题。在此基础上，相继出现了各种改进的SELEX方法，使筛选的效率逐步得到提高。

2.1 SELEX

2.1.1 SELEX的基本步骤 SELEX主要步骤如图1所示[12]：（1）构建包含1013～1015个单链寡核苷酸随机文库，每个序列的两端都含有固定的引物序列，用于后续的PCR扩增。筛选RNA适配体时，引物5′端需包含一段T7启动子，以识别DNA转录成RNA时必需的T7RNA聚合酶，从而得到随机RNA文库[13]。将靶分子加入到随机文库中，在特定缓冲体系中进行结合孵育;（2）充分结合后，洗脱未与靶分子结合的游离寡核苷酸，得到靶分子-寡核苷酸复合物;（3）分离与靶分子结合的核苷酸序列，洗脱和收集结合的序列;（4）以洗脱收集的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，形成富集文库，用于下一轮的筛选循环。通常经过6～20轮循环可筛选出高特异性、高亲和力的寡核苷酸;（5）对最后富集的文库进行克隆和测序，以获得最终特异性识别靶分子的适配体。在SELEX各步骤中，最关键的是将结合了靶标的适配体与未结合靶标的寡核苷酸进行分离，有效的分离方法可以筛选到具有高亲和力和高特异性的适配体。

2.1.2 硝酸纤维素膜过滤分离法 具有一定孔径的硝酸纤维素膜可使游离的寡核苷酸序列通过，而将与靶分子结合的寡核苷酸截留，从而使其与未结合的寡核苷酸分离。通过加热或加碱将与靶分子结合的寡核苷酸洗脱下来，再利用乙醇沉淀法回收ssDNA。Tuerk等[10]首次利用硝酸纤维素膜过滤的方法，经过至少12轮筛选，筛选出有机染料分子和噬菌体T4DNA聚合酶的适配体。Zhu等[14]利用脱氧核糖酶可催化过氧化氢氧化3， 3′， 5， 5′-联苯胺产生不溶性有色物质，而硝酸纤维素膜能截留此有色物质的特性，筛选出一种新型圆点印迹的脱氧核糖酶适配体。Wang等[15]采用此法，经过13轮筛选获得了针对禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白的适配体，解离常数Kd=4.65 nmol/L。

2.1.3 亲和色谱法 在琼脂糖或葡聚糖微球中固定靶标，将此树脂作为固定相填充到柱中，制备亲和层析柱，将随机文库作为流动相注入亲和层析柱中孵育，作为潜在适配体的寡核苷酸将与靶标发生亲和作用而结合在固定相上，用结合缓冲液冲洗掉未结合序列，然后用洗脱缓冲液洗脱结合在亲和柱上的寡核苷酸，得到适配体。利用此法已筛选出多种小分子适配体，如有机磷[16]、啶虫脒[17]和卡那霉素[18]等。其中卡那霉素适配体筛选是使用溴化氰活化琼脂糖柱固定的靶标，经9轮筛选后得到适配体，Kd=78.8 nmol/L。

2.1.4 磁珠法 将靶标固定于磁珠上，使随机文库与靶标磁珠混合孵育，亲和反应后外加磁场，去除含未结合寡核苷酸的上清液，得到靶标磁珠-ssDNA的复合物。此法只需少量靶分子，操作简单，分离方便。Mehta等[19]采用氯霉素包被的磁珠，经过8轮筛选，从ssDNA文库中筛选出两个亲和力较高的氯霉素DNA适配体7号和16号，适配体中G碱基的含量大于35%。此次得到的DNA适配体比以前的RNA适配体具有更高亲和力。用荧光法测定的Kd值分别为0.766 μmol/L和1.16 μmol/L。Kiani等[20]利用生物素与链霉亲和素的高亲和特性将生物素酰化的地高辛包被于链霉亲和素修饰的磁珠上，经过11轮筛选，得到地高辛的DNA适配体，Kd=8.2 nmol/L。

2.2 改进的SELEX

2.2.1 荧光磁珠SELEX 将靶分子固定在磁珠上，与随机文库混合孵育，利用荧光标记的引物进行定量的PCR扩增，通过观测荧光可实时监测结合到靶分子上的适配体的量，提高了筛选效率。孙美琪等[21]利用此法，将氯胺酮固定在修饰甲苯磺酰基的磁珠上，经过13轮筛选得到能特异性识别氯胺酮的两条DNA适配体，并利用荧光强度测得Kd值分别为0.59 μmol/L和0.66 μmol/L。

2.2.2 加尾SELEX 设计并合成组合文库，库中每个分子两端分别是4个碱基和6个碱基的固定序列。当对本轮筛选出来的序列进行扩增时，通过架桥序列使文库与引物片段连接，然后以桥接上去的片段为引物进行逆转录，对逆转录产物进行PCR扩增。扩增后的引物部分。可以通过碱裂解除去，从而使进入下轮筛选的仍是两端为短固定序列的次级文库。此法可以直接筛选出不含两端引物结合部位的适配体，无需进一步的引物截短处理。Vater等[22]利用该方法筛选出降钙素基因短肽的适配体。

2.2.3 消减SELEX 消减筛选（Substraction）可筛选出能够区分同源靶分子的特异性适配体。先用靶标以外的物质进行消减筛选，从随机文库中扣除可能的非特异性适配体，再用靶标对剩余部分进行筛选，得到高特异性的适配体。Wang等[23]采用此方法以非分化的PC12细胞为消减细胞，经过6轮筛选，得到了已分化的PC12的适配体。葸玉琴等利用此方法，以HIV gp41抗原作为消减抗原，经过6轮筛选，得到了3条HIV P24抗原的特异性适配体[24]。

2.2.4 切换SELEX 切换筛选可以筛选出对多种靶标都可以识别的适配体。通常要求多个靶标具有共同的结构域，筛选循环要根据不同的靶标进行策略的切换。White等[25]在筛选可识别人凝血酶和猪凝血酶的适配体时就采用了切换筛选的方法。在第一次筛选中同时使用人凝血酶和猪凝血酶两种靶标，之后的筛选依次交替使用人凝血酶和猪凝血酶，经过13轮筛选，得到一组对人凝血酶和猪凝血酶均具有亲和力的RNA适配体。Song等[26]将切换筛选与细胞筛选相结合，筛选出对大肠杆菌、产气肠杆菌、肺炎杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、枯草杆菌以及表皮葡萄球菌均有亲和力的适配体，此实验表明了从随机文库中分离出对不同属的细菌均具有亲和性的适配体的可能性。

2.2.5 镜像SELEX 镜像筛选利用手性分子具有旋光性的特点，从D-核酸文库中筛选出靶标旋光异构体的适配体，将筛选出的适配体合成为L-核酸，即为靶标的适配体，获得的左旋结构的适配体不易被核糖核酸酶识别，具有高稳定性。Maasch等[27]以高迁移率族蛋白A1为靶标，采用此方法筛选出其特异性镜像适配体NOX-A50，其解离常数Kd为7 nmol/L。

2.2.6 基因组SELEX 基因组筛选是将某生物的整个基因组作为寡核苷酸文库，将生物活性分子，如蛋白质、多糖、抗生素等作为靶标，从文库中筛选靶标的天然识别序列。此基因组文库需要包含全部的基因序列和全部的内含子序列。Shimada等[28]用此方法识别了大肠杆菌基因组中调节转录激活因子YbaO的物质-YbaOM操纵子，YbaOM操纵子与半胱氨酸降解有关。

2.2.7 细胞SELEX 细胞筛选是一种以完整的细胞作为靶标的筛选方法[29]。在靶标与随机文库混合孵育后，孵育液被离心处理。如果弃上清液中游离的核酸，则属于正向筛选方法。后续步骤是对沉淀中的核酸-菌体复合物进行变性，使细胞或菌体与核酸分离，通过离心回收上清液，并对上清液中的核酸进行PCR扩增， 作为下一轮筛选所用的次级文库。Duan等[31]利用此法，分别经过9轮筛选，得到副溶血性弧菌的适配体[30]和鼠伤寒沙门氏菌适配体。如果收集上清液中未结合的核酸作为次级文库， 再与靶标孵育，则属于反向筛选的方法，后续对经多轮筛选后的最后一轮沉淀进行变性处理，离心洗脱后获得的核酸即为该细胞的适配体[32]，陈鑫等[33]采用此方法，以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4为靶标，经过16轮筛选，得到了其3种特异性适配体，其中CX9序列结合率最高（17.2%）， Kd=16.2 nmol/L。

2.2.8 基于毛细管电泳（CE）的SELEX 2004年，Mendonsa等[34]将CE结合到SELEX中，CE具有的高效分离选择性特点使筛选的效率大大提高，一般仅需2～4轮即可达到SELEX 8-15轮的富集效率。他们以免疫球蛋白E（IgE）为靶标检验了此方法的能力。因寡核苷酸文库与靶蛋白IgE荷质比不同，结合后的寡核苷酸序列与游离文库间在自由溶液中存在淌度差别，利用CE可实现其分离，通过仅两轮筛选即可得到解离常数低至40 nmol/L的IgE适配体。与亲和层析中使用支持物不同，在使用CE的SELEX中，文库与靶分子的结合完全在溶液中进行，结合靶分子的序列与未结合靶分子的序列经CE分离后分别收集，不需要洗脱步骤，避免了固定相与连接臂引入的弊端，非特异性吸附大大降低，消除了动力学方面的缺陷[35]。由于大分子靶标与适配体结合后的荷质比与游离文库之间的淌度差明显，易于CE的分离，因此CE-SELEX筛选适配体的研究主要集中于蛋白等大分子靶标[36，37]。研究者也采用CE-SELEX筛选小分子靶标的适配体 [38，39]，Yang等[40]采用此方法经3轮筛选，获得小分子目标N-甲基-卟啉的8个DNA适配体，其中有2个可以催化卟啉的金属嵌入式反应。一般而言，采用基于CE的SELEX筛选小分子物质的适配体存在一定困难[41]。对CE-SELEX进行细分有几种方法。（1）平衡混合物的非平衡毛细管电泳（NECEEM） 将寡核苷酸文库与靶分子共同孵化，当二者达到平衡时，将混合物注入到毛细管中，在CE的高压电场中，靶标、核酸及靶标-核酸复合物根据淌度差异分离。在分离过程中，复合物不断解离，解离区域在CE分离时间段内表现为靶标（核酸）的拖尾或前伸峰，拖尾或前伸峰形与解离速率常数（Koff）呈指数关系。因此，在CE过程中可求出结合/解离平衡常数和速率常数（Kd， Koff和Kon）[42]。Krtlov等[43]研究了温度对Taq DNA聚合酶适配体的热化学反应影响，结果显示，温度变化会使适配体构型发生变化，进一步给出热力学结合参数焓变和熵变。NECEEM拓展了毛细管区带电泳模式应用的范围，适用于研究任何从弱到强的相互作用体系，是一种基于分离相关性的方法。此方法经1～3轮即可筛选出一个适配体，使筛选时间由SELEX的2～4周缩短为1天，而且还能同时测得适配体对靶分子的Kd值。该方法目前的应用报道主要集中于一些大分子蛋白适配体的筛选[36， 42]。Berezovski等[42]利用此法，经1轮循环即筛选出亲和力为1 nmol/L的PFTase的适配体。（2）平衡混合物的平衡毛细管电泳（ECEEM） 与NECEEM的原理基本相同，区别在于ECEEM的电泳运行缓冲液中有靶分子，且其浓度与平衡混合物中靶分子的浓度相同，在电泳过程中可以保持靶分子-适配体复合物的动态平衡。利用ECEEM可筛选到对靶标具有预设亲和强度的适配体[44]，还可以对筛选出的适配体克隆的亲和力进行快速评价[45]。（3）微型自由流电泳（μFFE） 在μFFE装置中，样品和缓冲液被各自的泵携带流入一个混合槽，在与缓冲液流动方向相垂直的方向施加电场，不同淌度的物质沿横向分开，在缓冲液流动方向横截面上的不同位置存在淌度不同的物质[46]。 Jing等[47]利用此装置建立了一种适配体CE筛选新形式，可以连续应用、分离、收集寡核苷酸文库。将100 μmol/L羧基荧光素（FAM）标记的随机文库与10 nmol/L IgE在由tris-甘氨酸-磷酸二氢钾组成的结合缓冲液中室温下孵育20 min，随后将混合物注入μFFE装置中，再注入分离缓冲液，施加电场后，在电渗流的作用下未结合的ssDNA与适配体-IgE复合物分离，收集结合序列，并进行PCR扩增。使用激光诱导荧光检测器检测，检测区位于进樣孔下方1.5 cm处的分离区域，在检测区利用相机通过显微镜记录每秒内未结合的ssDNA与适配体-IgE复合物的荧光图像。利用此方法成功筛选出了人IgE的适配体。此方法样品需求量小，收集装置简单，收集量大，污染或非特异性扩增的可能性低;而且用时少，施加的电场低，复合物解离的风险低;筛选速度快，单轮筛选就可以得到nmol/L级的适配体。但是这一方法需要特殊的μFFE装置，不利于推广。（4）毛细管电泳分区收集SELEX（FCE-SELEX） FCE-SELEX方法是在NECEEM模式的基础上，在靶标电泳峰和文库电泳峰之间，将适配体收集窗口划分为多段，将每段收集到单独的PCR管中，PCR管中装有油封的PCR混合物。采用这种油封的方法来分区收集，确保复合物的高效分离和收集，避免了PCR扩增过程中的污染。Luo等[48]采用此种方法，通过一轮筛选就得到了可与链霉亲和素结合的适配体，并通过表面等离子体共振（SPR）方法测得适配体SBA-36对链霉亲和素的亲和力为30.8 nmol/L。

2.3 非SELEX（non-SELEX）方法

Berezovski等[49]在NECEEM模式的基础上，提出了省却多次PCR扩增步骤的non-SELEX方法，上一轮分离后的非游离文库直接进入下一轮筛选过程，只需要对最后一次产物进行PCR扩增，简化了筛选过程，得到亲和力增强的收敛文库。此技术能使寡核苷酸文库对靶标的亲和力提高4个数量级。Non-SELEX最显著的优点是可用于那些不能进行PCR扩增的文库。Ashley等[50]利用non-SELEX筛选出解离常数为微摩尔级别的牛过氧化氢酶适配体，Tok等[36]利用该方法筛选出信号转导蛋白Cdc42-GTP、PAK1和MRCK的适配体。

3 适配体在农兽药残留检测中的应用

核酸适配体与传统抗体一样具有对特定靶标的识别能力，但其本身并不直接产生检测信号。因此，在农兽药残留检测方法中，适配体通常与其它可以产生信号的材料（如纳米金（AuNPs）、量子点等）构成复合探针，或与电化学电极等构成传感器的方式进行检测，其灵敏度能达到nmol/L～pmol/L， 甚至fmol/L级[51]，为农产品中农兽药残留的快速检测提供了新的解决方案。

3.1 适配体在兽药残留检测中的应用

早期的抗生素适配体研究主要是针对抗生素的RNA适配体，但是RNA不稳定，并不适用于抗生素残留检测分析，于是又逐渐筛选得到了抗生素的ssDNA适配体，并建立了多种方法用于抗生素的检测分析。

3.1.1 适配体在四环素类抗生素残留检测中的应用 Guo等[52]通过电沉积法将AuNPs固定在玻碳电极（GCE）表面，形成沉积金（DpAu）/GCE，再将四环素的适配体通过与AuNPs的配位作用结合在DpAu/GCE上，然后再在电极表面滴加亚甲基蓝（MB），形成MB/适配体/DpAu/GCE传感器。当加入与适配体亲和性更强的四环素时，其与MB对适配体的竞争结合使MB释放，电流值变小，通过电流的变化检测四环素的浓度（图2）。Zhang等[53]在检测牛奶中的四环素时，采用了同样的策略，在5 min内即可完成牛奶中四环素残留的检测。

Kim等[54]将生物素化的ssDNA适配体固定在链霉亲和素修饰的网状金电极上，构建了四环素电化学生物传感器，采用循环伏安法（CV）和方波伏安法（SWV）分析适配体与四环素间的结合作用，该适配体对四环素有良好的特异性。Kim等[55]将适配体电化学传感器用于检测土霉素，在金电极芯片上以硫醇修饰的适配体素，通过CV和SWV检测适配体与目标分子间作用产生的电化学信号。

3.1.2 适配体在氨基糖苷类抗生素残留检测中的应用 Song等[18]利用SELEX筛选到一个卡那霉素的ssDNA适配体Ky2，对卡那霉素、卡那霉素B和妥布霉素的解离常数分别为78.8、84.5和103 nmol/L。利用该适配体建立了卡那霉素的AuNPs比色分析法，其测定原理如图3所示。AuNPs与适配体通过配位作用结合，适配体可使其在BaCl2溶液中保持分散状态。当加入卡那霉素时，适配体构象变化，从AuNPs解离下来，失去适配体保护的AuNPs发生盐诱导聚集，颜色从分散态红色变化为紫色。卡那霉素浓度与620 和520 nm的吸光度比率A620/A520有关，卡那霉素浓度越高，比率越大。

Zhou等[56]将5′修饰巯基的卡那霉素适配体通过自组装方式连接到金电极表面，构建电化学传感器。卡那霉素后与适配体的结合使金电极表面覆盖率增加，阻碍电子传递，利用差分脉冲伏安法进行卡那霉素的测定。

de-los-Santos-lvarez等[57]利用甲基修饰的RNA适配体，结合SPR技术建立了竞争结合检测新霉素B的方法。将新霉素B固定在SPR传感器上，当加入新霉素B的适配体时，适配体与新霉素B作用，构象改变，使SPR信号变化，在低浓度条件下，随着适配体浓度的增加，角位移净改变量线性增大。当SPR传感器检测含有固定浓度适配体的样品时，样品中新霉素B将与固定于传感器上的新霉素B竞争结合适配体， 产生的SPR角位移净改变量信号随样品中新霉素B浓度升高而降低。

3.1.3 适配体在氯霉素类抗生素残留检测中的应用 Pilehvar等[58]建立了一種基于适配体电化学生物传感器检测氯霉素的方法。适配体通过自组装固定在金电极表面，当存在氯霉素时，电极表面的适配体变为发夹结构，使靶标接近电极，引发电子转移。此方法被成功用于牛奶样品中氯霉素的检测。高慧菊等[59]利用适配体对靶标的特异性和氧化钯纳米颗粒（PdO）标记聚合酶螯合物（EV）的双重信号放大效应，构建了一种氯霉素适配体传感器。他们将PdO与EV和互补DNA（cDNA）结合，组成信号探针cDNA-PdO-EV，同时将胶体金纳米颗粒与纳米磁珠、适配体结合为捕获探针偶联物，将捕获探针与信号探针杂交形成复合物，制得适配体传感器。检测氯霉素时，由于氯霉素与适配体间的特异识别性，使杂交复合物中的互补DNA与适配体解链，通过磁分离使信号探针留在上清液中，信号探针中的EV含有辣根过氧化物酶（HRP），HRP能够催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）发生颜色变化，同时PdO也能催化TMB变为蓝绿色，根据TMB在652 nm处的吸光度对氯霉素进行定量分析，并成功用于鱼肉和鹅肉样品的检测。

3.1.4 适配体在蒽环类抗生素残留检测中的应用 Chandra等[60]将磷脂酰丝氨酸（PS）和适配体作为生物识别分子，共同固定到AuNPs修饰的2， 2′，5′， 2′-三噻吩-3′-对苄磺酰胺基苯甲酸（polyTTBA）导电聚合物上，形成GCE/AuNPs/polyTTBA/PS-适配体/AuNPs传感器，利用电化学方法检测柔红霉素，电极捕获的柔红霉素越多，用CV扫描得到的电流越大。该方法具有很好的稳定性，已成功用于尿液样本中的柔红霉素的分析。

3.1.5 适配体在β-内酰胺类抗生素残留检测中的应用 Song等[61]以SELEX方法筛选氨苄青霉素的适配体，得到3个亲和性较高的适配体AMP4、AMP17和AMP18，解离常数分别为9.4、13.4和9.8 nmol/L。 他们将修饰FAM的适配体作为双探针，建立了基于AuNPs荧光和AuNPs比色检测牛奶中氨苄青霉素的方法。AuNPs可通过配位作用与FAM标记的适配体结合，使FAM的荧光猝灭，当加入氨苄青霉素时，适配体因与其结合而构象改变，并与AuNPs解离，FAM荧光得以恢复，通过检测FAM荧光强度从而测定氨苄青霉素浓度。如果向与FAM-适配体配位结合的AuNPs和氨苄青霉素的混合物中加入NaCl溶液时，适配体同样因与氨苄青霉素结合而构象改变，没有适配体保护的AuNPs因盐聚而颜色由分散态的红色变为聚集态的紫色，通过测定A520/A620的变化检测氨苄青霉素。

3.1.6 适配体在磺胺类抗生素残留检测中的应用 Yan等[62]同样利用适配体和AuNPs的配位结合特性，建立了一种检测磺胺二甲氧嘧啶的比色检测法，方法利用的是AuNPs具有类似过氧化物酶活性的特点。当向适配体修饰的AuNPs溶液中加入样品时，适配体与样品中磺胺二甲氧嘧啶结合使其从AuNPs上脱离，AuNPs由此恢复了催化活性，可以催化溶液中的底物TMB与过氧化氢的氧化反应，颜色从红色变为蓝色。通过测定650 nm处的吸光度测定磺胺二甲氧嘧啶的浓度，方法检出限低于MRL规定的100 ng/mL。

3.1.7 适配体在激素类药物残留检测中的应用 Liu等[63]利用AuNPs比色法实现了对17α-雌二醇的检测。他们研究了适配体的链长度对检测的影响，将17β-雌二醇76个碱基的适配体劈裂成两个片段P1和P2，分别含33和44个碱基，P1和P2的混合物在1 μmol/L浓度下就可达到原适配体1.5 μmol/L浓度防止AuNPs聚集的作用。因此，使用P1和P2混合物修饰AuNPs可以使靶标在浓度较低时就能引起AuNPs溶液颜色改变，劈裂的适配体可以使检测灵敏度提高10倍。

3.2 适配体在农药残留检测中的应用

3.2.1 适配体在有机磷农药残留检测中的应用 Wang等[16]以4种有机磷混合物（甲拌磷，丙溴磷，水胺硫磷，氧乐果）为靶标，经12轮SELEX筛选后得到2个亲和力较高的适配体SS2-55和SS4-54，4种有机磷的Kd为0.8～2.5 μmol/L。他们设计了5′-FAM-CTGCACAAGAATCGCTGCAG-DABCYL-3′作為分子信标，该信标与筛选出的适配体中间的核苷酸固定序列部分互补，分子信标的背景荧光强度较低，当其与适配体结合时，荧光增强，样品中的有机磷竞争结合适配体时，分子信标将与适配体解离，荧光强度与之前相比有所降低，降低程度与加入的有机磷浓度呈正相关，据此实现对有机磷的定量分析。Zhang等[64]利用分子信标与适配体建立了对同样4种有机磷农药的荧光检测方法，并成功用于甘蓝样品的检测。Pang等[65]在检测同样的4种有机磷农药时采用了一种将适配体的选择性识别作用与表面增强拉曼光谱（SERS）检测相结合的检测方法。巯基化的适配体通过Ag-S键被偶联在银枝晶表面，所得到的银枝晶-适配体偶联物作为SERS基底，用于苹果汁中4种有机磷农药的检测，此方法不仅能够对这4种有机磷农药进行定量分析，而且可以进行定性分析。Tang等[66]在检测这4种有机磷农药时，将适配体的互补序列（AMO）与羧基化修饰的CdTe/CdS核-壳型量子点（QD）偶联，此AMO-QD复合物可与适配体通过杂交反应继续偶联为AMO-QD-适配体复合物。当加入靶标有机磷后，适配体与有机磷的高亲和力使其从AMO-QD-适配体复合物上解离。利用CE对AMO-QD和过量的AMO-QD-适配体进行分离，并对分离后的两部分进行荧光强度测定。AMO-QD与AMO-QD-适配体的荧光强度比值随有机磷浓度的变化而变化，据此可进行定量分析，并成功用于苹果皮中这4种有机磷农药残留的检测。

在有机磷农药残留的检测应用中，很多研究者采用与文献[18]原理相同的AuNPs比色法，实现了对包括大米样品中的异稻瘟净和克瘟散的检测[67]， 以及环境水中水胺硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌百虫和伏杀硫磷的检测[68]。

3.2.2 适配体在新烟碱类农药残留检测中的应用 Fan等[69]构建了检测啶虫脒残留的一种将适配体电化学传感器。他们通过CV将50 nm 的AuNPs电沉积在裸金电极表面，形成具有更大表面积的AuNPs/金电极，AuNPs可与巯基化啶虫脒适配体通过Au-S键连接，形成高选择性的适配体/AuNPs/金电极，检测含有啶虫脒的样品时，适配体识别啶虫脒，在电极表面形成啶虫脒-适配体复合物，电子传递阻抗增加。啶虫脒-适配体复合物的解离常数Kd=23.41 nmol/L，适配体传感器对啶虫脒具有高特异性，吡虫啉、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、莠去津、氧乐果、毒死蜱和敌百虫基本不干扰测定。此方法用于废水和西红柿样品的检测。Shi等[70]对啶虫脒的检测则是采用了适配体AuNPs比色法，原理与文献[18]相同，已用于土壤的检测。Lin等[71]采用的方法则是将ZnS：Mn QD与啶虫脒的适配体结合，利用适配体芳核碱基与多壁碳纳米管（MWCNT）上C的sp2杂化轨道间的π-π堆积相互作用， 使适配体-QD固定在MWCNT上。QD和MWCNT可构成荧光共振能量转移（FRET）系统，作为能量供体的QD被310 nm光激发后，其激发能可迅速被能量受体MWCNT吸收， QD不发射荧光。当加入啶虫脒时，啶虫脒与适配体的高亲和性结合可破坏适配体-QD与MWCNT的相互作用，QD在580 nm处的荧光得以恢复，荧光恢复程度与啶虫脒的浓度呈正相关。此法已成功用于河水和大白菜样品的检测。