椰子分级蛋白制备的研究

马开创，黄宏飞，彭吟雪，何东平,2，胡传荣,2

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023；2.国家粮食局粮油资源综合开发工程技术研究中心，武汉 430023)

椰子不仅可以用来提取油脂，还是油料蛋白的重要来源之一。椰子蛋白中含有人体所需的18种氨基酸，8种必需氨基酸种类齐全，营养价值高，具有降血脂、降低胆固醇、抑制高血脂症等保健功能[1-3]。

在椰子加工中，椰子蛋白作为加工椰子油等的副产品，基本都用作饲料，造成了椰子蛋白资源的严重浪费[4]。虽然在特定区域制备椰子类食品有许多方法，但多数仅限于村庄或家庭规模[5]。如果椰子蛋白可以商业化生产，那么可以同时获得椰子蛋白和椰子油两个产品，从而整个椰子生产和加工业将受益匪浅。

目前关于椰子化学成分信息，尤其是蛋白质的信息不全，我国对椰子蛋白的研究报道很少。椰子蛋白中含有30%的清蛋白、61.9%的球蛋白、1.1%的醇溶蛋白和4.7%的谷蛋白[6]。本文对改良Osboren法提取椰子蛋白工艺进行优化，并对椰子蛋白的氨基酸组成和相对分子质量分布进行分析，以期为椰子蛋白的生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脱脂椰子粉(实验室自制)；氢氧化钠、氯化钠、盐酸、无水乙醇、正己烷、硼酸溶液；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒。

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器；K9840自动凯氏定氮仪；FD-8型冷冻干燥机；TD5A-WS离心机；PHS-3C型pH计；SZ-93自动双重纯水蒸馏器；垂直电泳仪；BIO-RAD凝胶成像分析系统；S-3000N扫描式电子显微镜、E-1055磁控溅射器，日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 椰子蛋白分级提取工艺

(1)清蛋白：取200 g脱脂椰子粉，过100目筛，置于烧杯中，加入一定量的蒸馏水，在恒温加热磁力搅拌器中一定温度下搅拌一段时间，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。沉淀加入蒸馏，再次搅拌浸提，离心。合并两次所得的上清液，用0.1 mol/L的HCl溶液调节上清液pH至4.5，在恒温加热磁力搅拌器中以45℃搅拌2 h，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷冻干燥即为清蛋白。在-4℃条件下储存。单因素实验时，固定提取条件为提取温度50℃、提取时间4 h、液料比10∶1。

(2)球蛋白：将提完清蛋白后的残渣用一定量0.5 mol/L的NaCl溶液进行浸提，在恒温加热磁力搅拌器中一定温度下搅拌一段时间，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。沉淀加入0.5 mol/L NaCl溶液，再次搅拌浸提，离心。合并两次所得的上清液后用半透膜在去离子水中过膜72 h，5 000 r/min、4℃离心30 min得到沉淀，冷冻干燥后得到球蛋白。在-4℃条件下储存。单因素实验时，固定提取条件为提取温度50℃、提取时间4 h、液料比10∶1。

(3)醇溶蛋白：将提完球蛋白后的残渣用一定量乙醇溶液进行浸提，在恒温加热磁力搅拌器中一定温度下搅拌一段时间(用保鲜膜密封)，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。沉淀加入乙醇溶液，再次搅拌浸提，离心。合并两次所得的上清液后进行旋转蒸发，冷冻干燥后得到醇溶蛋白。在-4℃条件下储存。单因素实验时，固定提取条件为提取温度50℃、提取时间4 h、乙醇体积分数75%、液料比10∶1。

(4)谷蛋白:将提完醇溶蛋白后的残渣加入一定量去离子水，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH，在恒温加热磁力搅拌器中一定温度下搅拌一段时间，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。沉淀用NaOH溶液再次搅拌浸提，离心。合并两次所得的上清液，滴加0.1 mol/L的HCl溶液至溶液pH降至4.5，然后在5 000 r/min、4℃条件下离心30 min。所得沉淀水洗至中性，冷冻干燥即为谷蛋白。在-4℃条件下储存。单因素实验时，固定提取条件为提取温度50℃、提取时间4 h、碱溶pH 10、液料比10∶1。

1.2.2 蛋白质含量的测定

参照GB 5009.5—2016 测定蛋白质含量。

1.2.3 椰子蛋白凝胶电泳分析

称取椰子蛋白样品0.01 g溶于5 mL上样缓冲液中，放入10 mL EP管中，涡旋振荡1 min后，在10 000 r/min下离心10 min，移液枪准确移取40 μL上清液与10 μL蛋白缓冲液充分混匀，在100℃加热3 min使蛋白质变性，准备上样。样品蛋白采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，按照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒方法进行检测。使用BIO-RAD GelDoc 2000凝胶成像仪对胶进行观察和分析。

1.2.4 椰子蛋白氨基酸组成分析

取一定量的椰子蛋白样品于60 mL水解管中，加入20 mL 6 mol/L的HCl溶液，充氮封管，在105℃下水解24 h，取出、冷却、开管，用去离子水无损转移至25 mL容量瓶中，并定容。准确量取1 mL水解液于旋蒸瓶中，蒸干，加1 mL水再次蒸干，用0.02 moL/L的HCl复溶并定容至10 mL容量瓶中，待衍生，然后利用L-8900氨基酸分析仪测定椰子蛋白的氨基酸组成。

1.2.5 数据处理

实验采用Excel 2010统计分析软件进行数据整理、分析、作图，显著水平取P<0.05(差异显著)，所有实验数据均为平均值(n=3)。

2 结果与分析

2.1 清蛋白提取条件的确定

2.1.1 单因素实验(见图1～图3)

图1 液料比对清蛋白提取率的影响

图2 提取温度对清蛋白提取率的影响

图3 提取时间对清蛋白提取率的影响

由图1～图3可见：清蛋白提取率随着液料比的增加先逐渐增大后趋于平缓，最佳液料比为10∶1； 清蛋白提取率随着提取温度的升高呈现先增大后减小的趋势，在50℃时达到最大值，这可能因为清蛋白超过50℃后发生了变性而凝聚[7]；清蛋白提取率随着提取时间的延长先增大后趋于平缓。

2.1.2 正交实验

根据单因素实验结果，以液料比、提取温度、提取时间为因素，以提取率为指标，采用正交实验设计优化清蛋白提取工艺条件。清蛋白提取正交实验设计及结果如表1所示。

由表1可知，影响椰子清蛋白提取率的因素大小顺序为液料比>提取时间>提取温度，液料比的影响最大，提取温度影响最小。最佳提取工艺条件为A2B2C2,即液料比10∶1、提取时间4 h、提取温度50℃，在此条件下清蛋白提取率为49.05%。

表1 清蛋白提取正交实验设计及结果

2.2 球蛋白提取条件的确定

2.2.1 单因素实验(见图4～图6)

图4 液料比对球蛋白提取率的影响

图5 提取温度对球蛋白提取率的影响

图6 提取时间对球蛋白提取率的影响

由图4～图6可见：球蛋白提取率随着液料比的增大呈先增大后逐渐平缓的趋势，在10∶1之前增加显著；球蛋白提取率随着提取温度的升高先增大后减小，在50℃时达到最大；球蛋白提取率随提取时间的延长先增加后减小，在4 h时达到最大。

2.2.2 正交实验

根据单因素实验结果，以液料比、提取温度、提取时间为因素，以提取率为指标，采用正交实验设计优化球蛋白提取工艺条件。球蛋白提取正交实验设计及结果如表2所示。

表2 球蛋白提取正交实验设计及结果

由表2可知，影响椰子球蛋白提取率的因素大小顺序为液料比>提取温度>提取时间，液料比的影响最大。最佳提取工艺条件为A2B2C2，即液料比10∶1、提取时间4 h、提取温度50℃，在此条件下球蛋白提取率为46.65%。

2.3 醇溶蛋白提取条件的确定

2.3.1 单因素实验(见图7～图10)

图7 液料比对醇溶蛋白提取率的影响

图8 提取温度对醇溶蛋白提取率的影响

图9 提取时间对醇溶蛋白提取率的影响

图10 乙醇体积分数对醇溶蛋白提取率的影响

由图7～图10可见：随着液料比的增加，醇溶蛋白提取率先增大，但增长趋缓，后稍微下降； 随着提取温度的升高，提取时间的延长，乙醇体积分数的增加，醇溶蛋白提取率均先增大后减少。醇溶蛋白主要由非极性氨基酸构成，乙醇中的羟基极性较强，可以增大溶解度，提取率上升[8]，随着乙醇体积分数继续增大，蛋白质发生变性，提取率降低。

2.3.2 正交实验

根据单因素实验结果，以液料比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数为因素，以提取率为指标，采用正交实验设计优化醇溶蛋白提取工艺条件。醇溶蛋白提取正交实验设计及结果如表3所示。

表3 醇溶蛋白提取正交实验设计及结果

由表3可知，影响椰子醇溶蛋白提取率的因素大小顺序为乙醇体积分数>提取时间>液料比>提取温度。醇溶蛋白最佳提取工艺条件为A2B3C3D2，即液料比10∶1、提取时间5 h、提取温度55℃、乙醇体积分数75%，在此条件下醇溶蛋白提取率为18.01%。

2.4 谷蛋白提取条件的确定

2.4.1 单因素实验(见图11～图14)

图11 液料比对谷蛋白提取率的影响

图12 提取温度对谷蛋白提取率的影响

图13 提取时间对谷蛋白提取率的影响

图14 碱溶pH对谷蛋白提取率的影响

由图11～图14可见：液料比在10∶1之前谷蛋白提取率随液料比增加而显著增加，随后增长缓慢；随着提取温度的升高谷蛋白提取率先增大后减小，在50℃时达到最大值；随提取时间的延长谷蛋白提取率先增加后降低，在5 h时达到最大值；谷蛋白提取率随碱溶pH的增大先提高后降低，在pH 10时达到最大值。

2.4.2 正交实验

根据单因素实验结果，以碱溶pH、提取温度、提取时间、液料比为因素，以提取率为指标，采用正交实验设计优化谷蛋白提取工艺条件。谷蛋白提取正交实验设计及结果如表4所示。

表4 谷蛋白提取正交实验设计及结果

由表4可知，影响椰子谷蛋白提取率的因素大小顺序为碱溶pH>提取温度>提取时间>液料比，碱溶pH的影响最大。谷蛋白最佳提取工艺条件为A2B2C2D2，即碱溶pH 10、提取时间4 h、提取温度50℃、液料比10∶1，在此条件下谷蛋白提取率为26.78%。

2.5 4种椰子蛋白的纯度和占比

在优化的提取条件下，100 g脱脂椰子粉提取得到的4种蛋白的纯度及占比见表5。

表5 4种椰子蛋白的纯度及占比

由表5可以看出，从椰子蛋白中分离得到的清蛋白和球蛋白的质量明显高于醇溶蛋白和谷蛋白的质量，二者占98.71%，球蛋白最多，占68.28%，清蛋白和球蛋白的纯度也较高。这是因为清蛋白和球蛋白属于可溶性蛋白，在水和盐溶液中溶解比较完全，分离较彻底。

2.6 4种椰子蛋白的相对分子质量分布(见图15)

从图15可以看出：椰子清蛋白的SDS-PAGE谱图主要有4条谱带，其相对分子质量从上至下为152.4、104.9、77.5、58.2 kDa；球蛋白主要有2条谱带，其相对分子质量从上至下为54.6、38.6 kDa；醇溶蛋白只有1条谱带，其相对分子质量为21.6 kDa；谷蛋白主要有4条谱带，相对分子质量从上至下为58.7、35.5、26.3、19.3 kDa。除了清蛋白有2条相对分子质量较大的谱带外，其余3种蛋白相对分子质量都较小，小分子蛋白更有利于人体吸收。

注：a.Marker标准蛋白；b.清蛋白；c.球蛋白；d.醇溶蛋白；e.谷蛋白。

图15 4种椰子蛋白的SDS-PAGE谱图

2.7 椰子蛋白的氨基酸组成(见表6)

表6 3种椰子蛋白的氨基酸组成g/100 g

氨基酸清蛋白球蛋白谷蛋白异亮氨酸2.33.63.5亮氨酸3.26.16.1赖氨酸4.73.43.2蛋氨酸0.92.61.8苯丙氨酸2.26.34.3苏氨酸2.93.72.9缬氨酸3.17.57.0组氨酸1.93.22.4酪氨酸4.13.12.9天冬氨酸6.59.39.1丝氨酸2.53.82.0谷氨酸19.816.913.7甘氨酸3.56.25.2丙氨酸3.43.93.3精氨酸17.314.712.8

由表6可知，3种椰子蛋白中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明显高于其他氨基酸，而蛋氨酸相对较缺乏。

3 结 论

(1)采用改良Osboren法对脱脂椰子粉进行分级提取得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，在单因素实验基础上，利用正交实验优化，得到最佳提取工艺条件为：①在液料比10∶1、提取时间4 h、提取温度50℃条件下，清蛋白提取率为49.05%，纯度为57.1%；②在液料比10∶1、提取时间4 h、提取温度50℃条件下，球蛋白提取率为46.65%，纯度为70.8%；③在液料比10∶1、提取时间5 h、提取温度55℃、乙醇体积分数75%条件下，醇溶蛋白提取率为18.01%，纯度为32.7%；④在液料比10∶1、提取时间4 h、提取温度50℃、碱溶pH 10条件下，谷蛋白提取率为26.78%，纯度为70.4%。

(2)椰子清蛋白、球蛋白及谷蛋白的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量明显高于其他氨基酸，而蛋氨酸相对较缺乏。清蛋白电泳图谱中有2条谱带相对分子质量较大，其余3种蛋白相对分子质量都较小。整体来说椰子蛋白是较为优质的蛋白质。