通城虎醇提物对大鼠的肾毒性研究

韦立志 廖作庄 杨斌 凌兰兴 王柳萍

(1.广西医科大学第二附属医院，广西 南宁 530007；2.广西医科大学药学院，广西 南宁 530021；3.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200)

通城虎，别名天然草、血萎、血藤暗消，收录于《广西中草药》，主要分布于广西的陆川、昭平、苍梧等地，具有祛风止痛，消肿解毒等多种功效[1-2]。临床煎汤内服应用于胃脘痛，腹痛，小儿惊风，咽喉炎等；外用捣敷可用于跌打损伤，风湿骨痛，毒蛇咬伤等病症，效果显著，在民间得到普遍运用[3]。然而，目前国内外对通城虎研究极少，尤其对其药效学研究和毒理学研究尚属空白。因此，本研究对通城虎醇提物的肾毒性进行探讨，为民间和临床安全用药提供安全性指导，从而使通城虎得到更好的使用和推广。

1 材料与方法

1.1实验动物 实验动物为健康的成年SD大鼠，雌雄各半，体重(230±20)g，大鼠及基础饲料均由广西医科大学实验动物中心提供(动物合格证：SCXK桂2009-0005)。动物饲养于广西医科大学实验动物中心，动物房为自然光照，温度为20～22 ℃，相对湿度为40%～60%。给予大鼠自由进食和饮水。

1.2药物，试剂和仪器 通城虎药材：由广西市场上采集得到的广西弄岗通城虎。利福平：规格0.15 g/粒，批号121112，成都锦华药业。水合氯醛(分析纯)：上海国药集团。NAG试剂盒：规格50T，批号20130115，购自南京建成生物工程研究所。主要仪器：电热恒温水浴箱(北京赛多利斯仪器有限公司)，全自动血生化分析仪(日立HITACHI，7100)，全自动血液分析仪(希森美康SYSMEX，XT-2000iv)，离心机：赛默飞世尔公司，型号：LEGENO MICRO 17R。5 mL 注射器、20 mL注射器、灌胃管、普通采血管、手术剪、刀片、开口器、手术镊。

1.3方法

1.3.1药品的配制 通城虎醇提物的制备：以6.5 kg通城虎生药和50 L 95%乙醇浓缩得到232 g/190.5 mL提取物(每1 g提取物相当于生药28.02 g)，即1.22 g/mL的提取物样品(每1 mL相当于生药34.12 g)。通城虎提取物溶液的配制：(1)按每只大鼠体重240 g，通城虎提取物每天剂量为260 mg/(kg·d)，高剂量的配制为：称取12.48 g通城虎提取液，装入研钵中，倒入10 mL吐温80，研磨混匀，加入20 mL纯水混匀，转入量筒，加纯水至400 mL。中、低剂量按此法各配制400 mL通城虎提取物溶液。10%水合氯醛溶液：5.0 g水合氯醛加入50 mL生理盐水(NS)中，搅拌均匀，配成10%溶液，现配现用。大鼠使用剂量为0.3 mL/100 g。

1.3.2分组及大鼠单肾切除手术 将SD大鼠随机分为五组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。除空白对照组以外，对其余各组大鼠进行右肾切除手术：大鼠在实验室适应3 d后，按体重用10%水合氯醛进行麻醉，将其置于手术台，在大鼠右侧腹部切开2 cm长的切口，暴露右侧肾脏，结扎肾门，将大鼠右肾摘除，逐层分别缝合腹壁肌肉和皮肤，在手术切口处给予利福平胶囊粉末进行杀菌处理。大鼠清醒后将其放回鼠笼，自由进食和饮水。每天对大鼠的活动状态和进食量进行观察记录。

1.3.3给药方法 术后术后第5天开始灌胃给药，给药前各组大鼠称量体重，高、中、低剂量组的给药剂量分别为通城虎醇提物260、130、65 mg/(kg·d)(相当于通城虎推荐的最高日用量的8倍、4倍和2倍)，空白组对照组和模型对照组给予相同体积的蒸馏水，1次/d，连续给药14 d。在给药期间观察动物的毛发、活动、精神、粪便、分泌物等情况，试验前后称量大鼠体重，并随体重变化调整给药量。

1.4实验数据测定 于末次给药前1 d分别将每只大鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，收集24 h尿液，离心取上清液，测定尿量，测定尿NAG酶。末次给药2 h后将大鼠麻醉，取材前禁食禁水，无菌环境下，将大鼠固定于手术台上进行腹主动脉取血。取部分全血检测红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)。其他全血经分离血清后用全自动生化分析仪测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)含量。处死大鼠并进行系统解剖，肉眼观察主要脏器组织有无异常的病理改变，胸、腹腔等体腔有无异常积液。称量心、肝、脾、肺、肾、等器官的湿重，按体重折算脏器系数(脏器重g/100 g体重)。将肝脏、肾脏组织固定，做HE 染色处理后进行组织形态学观察。.

2 结 果

2.1大鼠的一般情况 空白对照组大鼠正常摄食、饮水，生长良好，活动良好，无死亡情况。模型对照组大鼠造模后第5天，可见毛色恢复光泽，进食量岁偶有减少，但精神状态良好，活动正常。给药组得大鼠在给药第3天后开始出现毛发凌乱，颜色发黄干枯，食欲差等反应，高剂量组尤为明显；给药7 d后，可见给药组的部分大鼠活动减少，精神状态不佳，高剂量组的个别雌性大鼠出现明显消瘦。给药14 d后，高剂量组大鼠的2只大鼠死亡。

2.2大鼠的体重变化 与空白对照组和模型对照组比较，大鼠在右肾切除的条件下，给予通城虎醇提物后，低剂量组在给药5 d后体重增长速度均明显减慢，而高剂量组和中剂量组大鼠体重可见减轻趋势；14 d后给药组大鼠体重均比对照组减轻(P<0.05)。模型对照组与空白对照组对比无明显差异(P>0.05)。结果表明，通城虎醇提物可减轻右肾切除大鼠的体重。结果见图1。

图1 大鼠的体重变化曲线

2.3大鼠脏器系数的测定 不考虑体重变化前提下，与空白对照组比较，给药组大鼠被连续灌胃给药14 d，大鼠的肾脏脏器系数明显增加(P<0.01)；高剂量组与模型对照组比较，肾脏脏器系数明显增加(P<0.01)；各给药组大鼠的心、肝、脾、肺脏器系数与空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。模型对照组与空白对照组比较，肾脏脏器系数也增大(P<0.01)。结果见表1。但是在本实验中，由于给药各组大鼠的体重是减轻的，因此给药组大鼠脏器系数增大在对照组和药物试验组之间出现的显著性差异的原因有可能是给药组动物体重明显下降所造成的，不能作为评价证据。

表1 通城虎提取物对大鼠脏器系数的影响

注：与空白组大鼠相比较，**P<0.01。与模型对照组比较，ΔΔP<0.01。

2.4大鼠尿液指标的测定 与空白对照组比较，给药组大鼠的尿液指标NAG酶均高于空白对照组(P<0.05)，且随剂量的升高呈上升趋势。模型对照组NAG酶也略有升高，但与空白对照组比较无明显差异。各组大鼠尿量无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 通城虎提取物灌胃给药对大鼠尿量及尿NAG酶的影响

注：与空白组大鼠相比较，*P<0.05。

2.5大鼠肾功能血清生化指标的测定 与空白对照组比较，高剂量组大鼠血液中的BUN 、CREA 、UA指标均有明显升高(P<0.01)；中剂量组CREA、UA指标明显升高(P<0.05)，BUN差异无统计学意义；低剂量组CREA明显升高(P<0.05)，BUN、UA略有升高但差异无统计学意义。模型对照组与空白对照组比较无明显差异。见表3。

表3 通城虎提取物灌胃给药对大鼠肾功能指标的影响

注：与空白组大鼠相比较，*P<0.05，**P<0.01;中、低剂量组与高剂量组比较：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

2.6通城虎提取物对大鼠肝脏组织的影响 给药14 d后，对照组与给药组各组大鼠肝脏组织的肝索、肝窦、汇管区、肝小叶等结构均正常。见图2。

注：A.空白对照组；B.高剂量组；C.中剂量组；D.低剂量组。

图2肝脏组织变化(HE，20×)

2.7通城虎提取物对大鼠肾脏组织的影响 给药14 d后，高剂量组大鼠中出现小管水变性，部分区域片状小管溶解性坏死，残留小管有管型形成，但炎症反应并不明显，小球及血管未见明显病变。可见高剂量组的肾毒性已经形成，而中、低剂量组肾脏出现了不同程度的肾小管水变性，中剂量出现管形。见图3。

注：A.空白对照组；B.高剂量组；C.中剂量组；D.低剂量组。

图3肾脏组织变化(HE，20×)

3 讨 论

随着中药及中药制剂使用范围的扩大，中药相关的不良反应报道也日益增加，其中以“马兜铃酸(AA)肾病”最为引人注目[4-5]。马兜铃酸肾病(AAN)，又称关木通中毒性肾病，特指服用含马兜铃酸成分的中药如关木通、马兜铃、广防己、细辛、天仙藤、青木香等而导致的急性或慢性肾小管间质疾病[6]。AA的发病机制推测如下：(1)内质网应激反应机制；(2)氧化应激机制；(3)损伤物质聚积[7-8]。过量摄入马兜铃酸是导致AA的主要原因。通城虎来源于马兜铃科马兜铃属植物通城虎，含有马兜铃酸类化合物、木脂素、生物碱和有机酸等成分[9-11]，其中含马兜铃酸A，7-羟基马兜铃酸A 及木兰花碱马兜铃总酸性成分含量为0.60%，这些成分均可引起AAN，导致机体出现进行性肾间质纤维化，甚至可致癌致突变[12]，

本研究发现，给药8 d后，与空白组比较，发现各给药组大鼠的体重增长明显减慢(P<0.05)，其中高剂量给药组对体重影响较大，导致该组大鼠给药前后体重明显减轻(P<0.05)，空白组与模型组对比无明显差异。NAG是溶酶体酶之一，在肾脏近曲肾小管中含量最丰富，而溶酶体是各种攻击因子(如自由基、生物毒素、化学毒素等)容易侵犯的靶位，当近曲肾小管损伤时会迅速诱导溶酶体酶释放，尿中NAG酶显著增高，且较其他尿酶增高更早，因此尿NAG酶是反应肾小管损伤的敏感指标[13]。本研究发现，通城虎给药14 d后，高、中剂量组NAG酶明显升高(P<0.05)，低剂量组有一定升高但无统计学意义，表明大鼠肾脏受损，高剂量通城虎给药具有肾脏毒性。通城虎给药14 d，对尿量的影响，并未出现急性马兜铃酸肾病如少尿或非少尿性急性肾功能衰竭表现，推测是因为通城虎的给药剂量较小，而导致急性马兜铃酸肾病的主要原因是短期内大量服用含马兜铃酸的中草药。进一步对大鼠的肝脏和肾脏组织病理学改变进行观察，发现通城虎对大鼠的肝脏无明显影响，而一定剂量的通城虎提取物给药后可造成大鼠肾脏不同程度的损伤。综上结果，通城虎提取物连续给药14 d，即可造成大鼠明显的肾功能损害，表现为：体重降低，尿肌酐、血肌酐、血尿素氮、尿NAG酶升高，肾脏组织病理学改变。

在本试验中大鼠的给药计量分别为260、130、65 mg/(kg·d)，分别相当于生药7.29 g/(kg·d)、3.64 g/(kg·d)、1.82 g/(kg·d)。按生药药理试验动物与人体之间的等效剂量换算[14]，大鼠换算为成人的剂量是1∶0.162，即：按成人体重为60 kg，高剂量1 d用量为70.9 g。而通城虎推荐的最高日用量为9 g[3]，因此，高剂量差不多是推荐剂量的8倍，中剂量和低剂量则分别是4倍、2倍。但低剂量仍出现NAG酶及血清CREA升高的肾损伤指标。而且由于不同地域的通城虎毒性成分含量可能不同，因此在临床使用时一定要防止药物过量，做到个体化给药，若是存在肾脏疾病或肾功能障碍，则应该禁止使用；在用药过程中密切关注毒性反应，有条件的应该监测肾小管功能。