苗药九仙罗汉接骨汤促进SD大鼠胫骨骨折愈合中TGF-β1动态表达

罗清龙 唐良华 熊屹 刘玉召

(1.四川省德昌县人民医院骨科，四川 德昌 615500；2.贵阳中医学院第二附属医院骨二科，贵州 贵阳 550002；河南省开封市人民医院骨科，河南 开封 475000)

骨折是指骨的力学完整性、连续性的丢失，继而患者自感伤处疼痛，体查发现骨折处出现肿胀、功能障碍及局部骨擦音、异常活动等表现的一类疾病，常因外伤而引起，是最为常见的外科疾病之一。苗医药加速骨折愈合的动物实验、病例研究报道较少。本实验组运用现代基因及蛋白检测的技术，检测苗药九仙罗汉接骨汤对SD大鼠胫骨骨折后TGF-β1细胞因子的动态表达，以探究其加速骨折愈合的机理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8周龄健康SD大鼠120只，SPF级，雌雄各半，体重(220±20) g，由贵阳中医学院动物所购买。许可编号：SCXK-(军)2012-0011。

1.1.2实验药物 九仙罗汉接骨汤煎剂由仙桃草20 g、九节茶15 g、地罗汉3 g组成。九仙罗汉接骨汤的成人(70 kg)每日剂量为生药0.54 g/kg，按人/鼠体表面积比率换算等效计量法计算后，每只每天0.68 g/mL，稀释至0.17 g/mL。按传统方法煎煮后无菌封瓶，4 ℃冷藏柜储存备用。生理盐水(均由贵阳中医二附院提供)。

1.1.3主要试剂和仪器 SABC免疫组化试剂盒(Biomics公司)；DAB显色试剂盒及一抗、二抗、PBS缓冲液(Boisynthesis公司)；EDTA脱钙液(pH 7.2)、4%多聚甲醛、二甲苯、Goldview Ⅰ(美国Solarbio公司)；TriZol总RNA提取试剂、反转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒、5x RNA Loading Buffer(TaKaRa Bio公司)；7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；琼脂糖凝胶电泳仪、琼脂糖凝胶电泳槽(BIORAD公司)；NanoDrop2000超微量分光光度计(德国Thermo Scientific公司)、显微图像分析仪(德国opten公司)。

1.2方法

1.2.1骨折模型的建立(改良钻孔法) 大鼠采用腹内注射法麻醉(7%水合氯醛，0.5 mL/100 g)，麻醉满意后予6%的硫化钠左下肢脱毛备皮，清洁纱布擦拭，右侧卧位放于造模台上，自制固定模具使左小腿水平放置。碘伏棉球由左足到左大腿上段消毒3遍。无菌布巾覆盖展露造模区四周，钳定稳固。于胫骨结节下2 mm沿胫骨脊切长约1.5 cm纵行切口，分拨鼠外皮，继续沿胫骨脊外侧缘0.5 mm纵轴方向切开浅、深筋膜层，分拨开胫骨前肌群，展露胫骨外骨面。充分显露术野后，小功率钻在鼠膝关节胫骨结节下2 m处由胫骨外骨面向髓腔造孔道1，钻头直径为0.3 mm，可钻达髓腔，但不破坏内侧骨外皮质，原孔道1处换1 mm钻头扩大孔道，在第一孔下沿胫骨纵轴方向，孔间距2 mm，依照前法造孔道2及孔道3。生理盐水冲洗后，分层缝合切口处组织，适量红霉素软膏外敷伤口及周缘，麻醉清醒后分笼饲养，此后持续3 d给予8万单位青霉素肌内注射[1]。

1.2.2分组及标本取材 所有造模成功大鼠随机均分成接骨汤组、生理盐水组。接骨汤组麻醉复苏后灌予九仙罗汉接骨汤，2 mL/次，Bid，生理盐水组灌予等量生理盐水。常规分笼饲养。术后1、3、7、14、21、28 d分批拉颈处死，每组各10只，以造模处为中心取10 mm骨段。

1.2.3免疫组化技术检测骨痂组织中TGF-β1表达 截取5 mm骨段，4%多聚甲醛淹没标本，4 ℃冰箱下固定24 h，予PBS液清洗×3次，20 min/次。移至EDTA中脱钙，量约10mL ，更替EDTA液1 W/次，持续30 d。不锈钢针插入后未感受阻力，此情况提示脱钙达标。2%NaOH浸泡，时间10 min，双蒸水洗，时间10 min。依次经乙醇脱水六次，放入无水乙醇与二甲苯比例1∶1液体中20 min，转移至纯二甲苯20 min。侵蜡30 min。包埋后运用切片机以骨折端中央为中心纵行切开制成5 μm厚的蜡片，40 ℃水中展片至无皱褶，放置于60 ℃烘箱40 min，烘干切片。依次经脱蜡至水、抗原修复、染色、显色剂显色、复染、分化、蓝化、脱水后中性树脂封片，光镜观察。结果判定：蛋白水平表达与大鼠胫骨骨痂组织中出现褐黄色颗粒数及颜色深度呈正相关性。未显褐黄色者为阴性。10×40倍光镜下视检采图，所得骨组织片再在10×10倍光镜下随机抽取3个视野作阳性表达计数，各标本TGF-β1表达的计量指标以3个视野计数均值为准。

1.2.4q-PCR检测骨痂细胞中TGFβ1mRNA表达量 研磨钵在180℃环境烤干1.5～2h，将从-80℃冰箱中取出已备好的骨痂组织用骨钳夹碎后放入研磨钵中，棒研磨标本加入覆盖骨痂组织的液氮后使用研磨成细粉，提取骨痂组织中的总RNA。所选基因引物序列由上海凯信生物科技有限公司设计合成。TGF-β1扩增片断长度为111 bps，其上游引物序列为：5’TCAATACGTCAGA-CATTCGG3’，下游引物序列：5’TACCAAGGTAACGCCAGGA 3’。同时以扩增片段长度155 bp 的actin 作为内参照，actin上游引物序列：5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游引物序：5’-AGAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’。采用琼脂糖凝胶电泳法测定总RNA完整性。NanoDrop2000超微量分光光度计进行总RNA浓度及OD260/280检测，测定总RNA质量是否达到实验要求。在ABI 7500 PCR器上进行操作，反应设置为：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，1 min。重复第2步，共40个循环。采用染料法(SYBR Green I)进行TGF-β1mRNA相对定量分析，用2-△△ct法分析结果。

2 结 果

2.1实验动物分析 骨折模型的制作过程中，4只SD大鼠因麻醉不当而死亡，均予以补充。大鼠左胫骨造模术口均愈合良好，无一例感染。拉颈处死前所有大鼠均健活，且生长良好，饮食、二便、呼吸频率、精神状态和活动均正常，口、鼻、耳、眼均无异常分泌物，说明苗药九仙罗汉接骨汤口服具有一定的安全性。

2.2免疫组化检测结果分析 TGF-β1蛋白表达水平与大鼠胫骨骨痂组织中出现褐黄色颗粒数及颜色深度呈正相关性。与生理盐水组相比，接骨汤组中TGF-β1的MOD值在骨重建14～28 d时差异显著(P<0.01)。该结果提示在苗药干预后14～28 d接骨汤组中的TGF-β1的平均光密度值的升高程度明显高于生理盐水组。接骨汤组骨折模型所取标本中骨祖细胞数量、成软骨细胞数量、骨小梁出现的时相及重建程度均优于生理盐水组。见表1、图1。

表1 不同时相中TFG-β1平均光密度值

注：与生理盐水组比较▲P<0.01。

图1 两组不同时相TGF-β1的免疫组化检测( ×400)

2.3q-PCR方法检测结果 理想的RNA纯度A260/A280应在1.9～2.1范围之间。经检测，各组总RNA的纯度及浓度符合实验要求。骨痂组织总RNA提取结果可明显见28S、18S条形光带的出现，且28S条形光带明亮度约为18S条形光带的2倍，条带周围未见拖尾现象，说明接骨汤组和生理盐水组中样本提取的RNA具有良好的完整性，符合本实验要求，见图2。

图2 总RNA琼脂糖凝胶电泳

2.4不同时间中TGF-β1mRNA相对表达情况 接骨汤组在造模后第1～3天TGF-β1mRNA表达量与生理盐水组相当(P>0.05)；在7 d时接骨汤组表达量是生理盐水组的1.34倍，相较有差异(P<0.05)；在14 d时接骨汤组表达量是生理盐水组的1.45倍，在21 d时接骨汤组表达量是生理盐水组的1.85倍，在28 d时接骨汤组表达量是生理盐水组的2.05倍，14～28 d时相同时相比较均有显著差异(P<0.01)。见表2。

表2 不同时间中 TGF-β1mRNA相对表达

注：与生理盐水组比较，△P<0.05，▲P<0.01。

3 讨 论

苗族医者认为气与血是人体的重要要素，其与人体健康密切相关，因此“气常阻，血常瘀”是人体发病的重要原因之一。本课题组从中医“骨折三期分治”和苗医“通气散血法”、“毒乱致病论”相结合下的理论指导下挖掘出民间经验方苗药九仙罗汉接骨汤，其具有活血化瘀、通络止痛、接骨续筋之功效。方中药物由仙桃草、九节茶、地罗汉组成。先现代药理学来看，绿原酸做为仙桃草主要成分之一，其能够明显的加快成骨折后骨细胞增殖分化，从而加速骨折愈合[2]。方芳等[3]对仙桃草促进骨折愈合机制进行探讨，通过兔骨缺损造模仙桃草干预性治疗后检测VEGF细胞因子，发现单味苗药仙桃草可在骨重建早期提高VEGF的表达，获得加速骨重建的效应。仙桃草内服能促进骨不连模型兔骨折端中BMP-2、VEGF表达从而使兔桡骨骨不连得到改善[4-5]。临床研究[6]也表明仙桃草具有帮助骨折断端重建、修复的效果。本实验组前期[7-9]，通过苗药九仙罗汉接骨汤干预兔胫骨干骨折动物模型，并以血Ca、血P、ALP、X线片评定骨痂生长、HE染色及VEGF免疫组化结果为指标，发现苗药九仙罗汉接骨汤使骨痂成型加快，进而有减少骨折愈合时间的效果。

TGF-β家族都是由两条相同肽链组成的多肽。研究[10-11]发现，相对于TGF-β2和TGF-β3只有在软骨形成期才能表达，TGF-β1在骨重建启动后表达的时间最长，且在骨组织中含量较高。组织中的TGF-β1在骨折后重建过程中，具有加快成骨母细胞有丝分裂的的生物学功能，增加骨折部位成骨细胞、成骨基质的募集，并且在整个骨重建的过程中TGF-β1都会周期性增长并参与整个骨折愈合的调节，只是在不同时期TGF-β1表达情况不同。本研究结果中，接骨汤组与生理盐水组的TGF-β1蛋白及基因的表达均呈阶梯性增长，再次验证了TGF-β1参与整个骨折愈合过程。TGF-β1是骨重建过程中软骨内成骨的标志性因子之一[12]。相关研究[13]发现，通过桃红四物汤调控外源性TGF-β1，作用于骨母细胞，从而对成骨细胞的数量及活性进行调节，加快骨重建。本研究结果中，1～7 d时，接骨汤组与生理盐水组TGF-β1平均光密度值同一时段相当。而在14～28 d时，接骨汤组14～28 d时间内MOD值显著高于生理盐水组。接骨汤组在造模后第1～3 d TGF-β1mRNA表达量与生理盐水组同一时段相当；而在7～28 d时相内，接骨汤组TGF-β1mRNA表达量分别是生理盐水组的1.34倍、1.45倍、1.85倍、2.05倍。两组TGF-β1基因及蛋白的表达量在骨折愈合过程中随时相的增加而阶梯性增长，但生理盐水组表达明显低于接骨汤组。免疫组织化学检测中，接骨汤组骨折模型所取标本中骨祖细胞数量、成软骨细胞数量、骨小梁出现的时相及重建程度均好于生理盐水组。

综上，通过九仙罗汉接骨汤干预后增强TGF-β1表达从而有效的缩短了模型鼠骨重建的时间。不足之处在于，此次实验中只是根据不同时相进行分组，未探究苗药九仙罗汉接骨汤低、中、高浓度的最佳配比，得出最佳效果；其次，苗药九仙罗汉接骨汤的毒副作用实验尚未完善，均拟在下一步实验中继续探究。