柑橘皮黄酮石灰水提取工艺及果胶去除效果的研究

李继伟，任璇，周绍庆，李媛，刘梦蝶，焦雄

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205）

柑橘皮渣是柑橘加工的副产物，我国每年产生的柑橘皮渣均在500 万吨以上[1]。柑橘皮渣中含有黄酮、果胶等多种生物活性物质。黄酮类化合物具有降低血糖血脂[2-4]、调节肠道微生物[5]、调节消化酶活性[2-3，6-7]、促进消化[8]、抗氧化[9]等多种生理功能，有很高的食用、药用价值[10]。

溶剂提取法是黄酮提取最常用的方法，乙醇是黄酮提取最常用的溶剂，但其成本较高。碱法提取黄酮是一种廉价、有效的方法。本课题组前期选用氢氧化钠水溶液进行柑橘皮黄酮的提取，但可溶性果胶也会一起被提取出来，造成黄酮提取液易凝胶化，给后续纯化带来困难。所以，怎样经济高效地提取黄酮，同时又方便黄酮的后续纯化，是柑橘皮黄酮利用中亟待解决的问题。

柑橘皮渣中存在大量果胶，可溶性果胶能与Ca2+形成“蛋箱型”结构而降低其溶解度，所以在提取过程中使用钙盐可降低杂质果胶的含量。本试验选用石灰水为提取剂，通过单因素和正交试验来优化柑橘皮黄酮的提取条件。同时，对石灰水提取法、NaOH 提取法和乙醇提取法3 种方法的黄酮得率及所得黄酮提取液中的果胶含量进行比较，以期为柑橘皮黄酮的提取及开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柑橘皮：60 ℃烘干，粉碎，过40 目筛，干燥器保存备用。

芦丁标准品（纯度≥98%）、无水乙醇（分析纯）、α-萘酚（分析纯）、咔唑（纯度≥97 %）、浓硫酸（优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；半乳糖醛酸（纯度≥97%）：上海金穗生物科技有限公司。

SHZ-88 型水浴恒温振荡箱：金坛市医疗仪器厂；TDL-5-A 型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；722 型可见光分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 石灰水法提取黄酮流程

取柑橘皮0.5 g，加入一定稀释度的饱和石灰水，放入恒温水浴振荡箱中以120 r/min 振荡提取，5 000 r/min离心10 min，取上清，即为黄酮粗提液。

1.2.2 黄酮得率的测定方法

芦丁标准曲线的绘制参照李继伟等[11]的方法，以芦丁含量x（mg）为横坐标，以吸光值y（OD510）为纵坐标，绘制标准曲线，所得回归方程为：y=1.169 1x+0.001 4，R2=0.999 9。样品中黄酮含量的测定依照标准曲线，柑橘皮黄酮得率 P（mg/g）=cV/M

式中：c 为提取液黄酮含量，mg/mL；V 为提取液体积，mL；M 为柑橘皮粉末质量，g。

1.2.3 石灰水法提取黄酮的单因素及正交试验方法

选取饱和石灰水稀释倍数（原液、2、4、8、16、32倍）、水浴时间（0、0.5、1、2、4、6 h）、水浴温度（20、40、60、70、80、90 ℃）和液料比（10、20、30、40、60、80 mL/g）共4个因素进行单因素试验，每组试验至少重复两次，结果取平均值。根据单因素试验结果，进行三因素三水平正交试验，获得柑橘皮黄酮提取的最优条件，并进行验证。

1.2.4 不同黄酮提取方法的比较

1.2.4.1 不同提取方法对柑橘皮黄酮得率的影响

分别以石灰水、乙醇和NaOH 为提取剂，提取柑橘皮中的黄酮，并对黄酮含量进行比较。每种提取方法的最佳条件均为本实验室前期优化所得。其中，石灰水法的提取条件为：饱和石灰水稀释4 倍，液料比30 mL/g，90 ℃水浴时间2 h；乙醇法的提取条件为：乙醇浓度 60%，液料比 30 mL/g，70 ℃水浴 2 h；NaOH 法的提取条件为：NaOH pH 12，液料比30 mL/g，90 ℃水浴3 h。

1.2.4.2 不同提取方法对黄酮提取液中果胶含量的影响

1）半乳糖醛酸标准曲线的绘制

半乳糖醛酸标准曲线的绘制参照尚雪波等[12]，并稍有改动，具体步骤如下：精密称取半乳糖醛酸5 mg，蒸馏水定容至50 mL，即得100 μg/mL 的标准溶液。精密量取上述标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 分别置于试管中，加入蒸馏水定容至1 mL，加入0.1 %咔唑-乙醇溶液0.25 mL，加入浓硫酸5 mL，85 ℃水浴20 min，以第一管为空白对照，用分光光度计在525 nm处测吸光值，以半乳糖醛酸含量x（μg）为横坐标，以吸光值y（OD525）为纵坐标绘制标准曲线，所得回归方程为：y=0.013 9x-0.004，R2=0.999 5。

2）柑橘皮中总果胶测定方法

柑橘皮果胶含量的测定参照丁建东等[13]，并稍有改动，具体方法如下：称取1 g 柑橘皮，加入75%乙醇溶液 35 mL，80 ℃水浴 10 min，5 000 r/min 离心 10 min，弃去上清液。重复上述步骤，直到上清液不再产生molish 反应。用蒸馏水将沉淀洗入100 mL 容量瓶中，加入1 mol/L 的氢氧化钠溶液5 mL，用蒸馏水定容至100 mL，80 ℃水浴振荡 15 min，然后 5 000 r/min 离心10 min。取上清，参照标准曲线方法测定果胶含量，即为可溶性果胶含量。果胶含量P/%=（cV×103/M）×100

式中：c 为溶液中果胶浓度，mg/mL；V 为溶液体积，mL；M 为样品质量，g。

收集上述步骤所得沉淀，加入1 mol/L 硫酸溶液25 mL，沸水浴 1 h，冷水浴快速冷却，5 000 r/min 离心10 min，取上清液，用蒸馏水定容至200 mL，参照标准曲线方法测定果胶含量。不溶性果胶含量计算同可溶性果胶。重复本步骤两次，将3 次所得果胶含量相加，即为不溶性果胶含量。

总果胶含量（%）=可溶性果胶含量（%）＋不可溶果胶含量（%）。

3）不同方法提取的果胶比率的测定方法

由于提取液中含有还原糖等干扰成分，所以采用差减法测定不同方法提取的果胶比率，即提取的果胶比率（%）=柑橘皮中总果胶含量（%）－残渣中果胶占原粉末的比率（%）。参照上述方法，测定1.2.4.1 中不同提取方法所得残渣中果胶的量，计算并比较各提取方法提取的果胶比率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 饱和石灰水稀释度对黄酮得率的影响

饱和石灰水稀释倍数对黄酮得率的影响见图1。

图1 石灰水浓度对黄酮得率的影响Fig.1 The effect of lime water concentration on the extraction rate of flavonoids

黄酮得率随饱和石灰水稀释度的增加先上升后下降，当稀释倍数为8 倍时，黄酮得率最高为5.16 mg/g。这可能是因为低浓度的石灰水不利于黄酮提取，而高浓度的石灰水pH 值过高（试验测得饱和石灰水的pH值为13.56）对黄酮有一定的破坏作用。所以饱和石灰水的稀释倍数8 倍为最佳。

2.1.2 水浴时间对黄酮得率的影响

水浴时间对黄酮得率的影响见图2。

图2 水浴时间对黄酮得率的影响Fig.2 The effect of water bath time on the extraction rate of flavonoids

黄酮得率随水浴时间的延长呈现先快速增加后逐渐平稳的趋势，水浴时间从0 h 增加到2 h 时，黄酮得率从3.64 mg/g 提升到5.09 mg/g，水浴时间继续延长至6 h 时，黄酮得率为5.2 mg/g，增加缓慢，考虑到时间成本，故选择最优水浴时间为2 h。

2.1.3 水浴温度对黄酮得率的影响

水浴温度对黄酮得率的影响见图3。

图3 水浴温度对黄酮得率的影响Fig.3 The effect of water bath temperature on the extraction rate of flavonoids

随着水浴温度的升高，黄酮得率先增加然后趋于平稳；水浴温度从20 ℃上升至80 ℃时，黄酮得率从3.95 mg/g 增加到最高5.05 mg/g，当水浴温度升高至90 ℃时，黄酮得率基本保持不变。故选择80 ℃为水浴最优温度。

2.1.4 液料比对黄酮得率的影响

液料比对黄酮得率的影响见图4。

图4 液料比对黄酮得率的影响Fig.4 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate of flavonoids

黄酮得率随液料比的增加而增加，当液料比为10 mL/g 时，黄酮得率为4.35 mg/g，液料比增加到30 mL/g 时，黄酮得率达到最大，为5.06 mg/g，随着液料比的再增加，黄酮得率基本维持不变。故选择液料比30 mL/g 为最优条件。

2.2 正交及验证性试验结果及分析

选取饱和石灰水稀释度、水浴时间、水浴温度进行三因素三水平的正交试验，其余因素为单因素最佳水平，结果见表1。

表1 正交水平试验结果表Table 1 Table of orthogonal experimental results

各因素对黄酮得率的影响依次为：水浴时间＞饱和石灰水的稀释倍数＞水浴温度，提取的最优条件组合为A1B2C3，对优组合进行验证，黄酮的得率为（5.15±0.03）mg/g，表明正交试验所得结果可靠，即最佳提取条件为：饱和石灰水稀释4 倍、水浴时间2 h、水浴温度90 ℃。

2.3 不同黄酮提取方法比较的结果

不同黄酮提取方法的比较结果见表2。

表2 不同提取方法的比较Table 2 Comparison of different extraction methods

分别以石灰水、乙醇和NaOH 为提取剂，其中石灰水法黄酮得率为5.15 mg/g，与NaOH 提取法黄酮得率的5.26 mg/g 相差不大，但都大于乙醇提取法的黄酮得率，所以石灰水和NaOH 都可以较好的提取柑橘皮中的黄酮。

试验测定，柑橘皮中，可溶性果胶的含量为4.68%，不可溶性果胶的含量为10.68%，总果胶含量为15.36%。其中，乙醇法提取的果胶比率最低，为0.82%；石灰水法提取的果胶比率次之，为1.7%；NaOH 法提取的果胶比率最高，为4.67%，且石灰水提取法和乙醇提取法提取的果胶都远低于NaOH 提取法，有利于黄酮类化合物的后期纯化。

3 结论

石灰水提取柑橘皮黄酮的最佳条件为：饱和石灰水稀释倍数为4 倍、液料比为30 mL/g、90 ℃水浴2 h，最大黄酮得率为（5.15±0.03）mg/g。试验测得柑橘皮中果胶的含量为15.36%，与文献相符[12]。不同提取方法比较发现，NaOH 法黄酮得率与石灰水法相近，但均高于乙醇法。石灰水法黄酮得率与NaOH 法接近，提取的果胶杂质却大幅降低，由4.67%降至1.7%，降低了63.6%，所以结合后期纯化综合考虑，石灰水法优于NaOH 提取法，而乙醇提取法虽然杂质果胶含量低，但黄酮得率也较低，而且溶剂成本较高，也会溶解更多脂溶性杂质（如柑橘精油等）。所以石灰水提取法既能有效的提取柑橘皮中的黄酮，又有利于黄酮的后期纯化。