不同发酵条件下红曲霉产Monacolin K的沙棘籽粕发酵菌质的特征性成分研究

张佳婵，王昌涛，孙宝国，4，*，王成涛，杨帆

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；3.北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；4.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048；5.云南白药集团股份有限公司，云南 昆明 650000）

红曲霉是一种重要的药食两用微生物资源，在我国应用红曲霉发酵生产的红曲米，已经有上千年的历史，近现代发展也产生其他多种食品，红曲黄酒、腐乳、酱菜、果酒等[1-2]。此外，红曲霉还用于保健和医药领域，红曲霉具有多种有益成分，如血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽、γ-氨基丁酸、支链氨基酸、红曲红色素、红曲黄色素等，其中又以Monacolin K 最为重要[3-5]。早在上世纪80年代，日本学者从红色红曲霉中分离出了一系列Monacolin 活性成分，被统称为他汀同系物（Monacolins）。这些他汀类物质具有显著的降血脂功效，能够显著降低人体内源性胆固醇的合成，抑制细胞内胆固醇的贮存；能够显著降低血液中低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的含量，有效预防动脉粥样硬化，具有高效、低度和安全的特点[6]。但是微生物产Monacolin K 的产率很低，需用稻米为发酵基质，生产成本较高，限制了它的广泛应用。

为了能够提高Monacolin K 的产量，降低生产成本，广大科研工作者逐渐尝试并开展了发酵添加物或其他低成本基质在生产Monacolin K 上的应用。柴诗缘等探索了10 种添加物对红曲霉Monacolin K 产量的促进效果，发现添加谷氨酸可以显著提高Monacolin K的产量[7]。碳氮比是微生物固体发酵中的重要考量因素，碳氮比的差异影响着微生物次级代谢产物的积累[8]。陈勉华等利用不同发酵基质发酵红曲霉，观测其对不同次级代谢产物的影响，研究发现大米复配麦麸较单纯使用大米为发酵基质的红曲产品，其Monacolin K 的含量增加了1 倍[9]。此外，也有部分学者力求通过基因改造、物理诱变等手段选育高产红曲霉次级代谢产物的菌株，也取得了一定的效果，但诱变菌株活力易衰减、条件不可控，此类技术还不成熟[10]。也有研究者发现不同封口方式对红曲霉产Monacolin K 的含量也有影响[11]。

利用农林副产物作为发酵基质用于微生物次级代谢产物或菌体的生产方式已有多年发展历史。应用于发酵的农副废料有畜禽羽毛[12]、稻草[13]、玉米芯[14]、藻类[15]、面包屑[16]、厨余残渣[17-18]以及果皮[19-20]等。以红曲霉为菌种的固体发酵农副废料的研究也迅速开展。Babitha 等利用波罗蜜种子进行红曲霉的固体发酵用于红曲色素的生产并确定了发酵工艺[21]；Srianta 等将多种谷物基质应用在紫红曲霉（Monascus purpureus）的发酵中，探讨了多种基质对菌丝生长状态、色素产量以及基质活性成分变化的影响，发现去壳高粱粒更有助于菌丝的生长和色素的积累[22]。Wang 等将赤红曲霉（Monascus anka GIM 3.592）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae GIM 2.139）混合发酵番石榴叶以获得多酚类提取物[23]。这些研究的目的多为获得色素、酶类或改善基质条件，较少以Monacolin K 为目的产物的副产物发酵研究。

沙棘籽粕（sea bucthorn seed residues，SBSR）是沙棘籽脱油后的副产物，常被作为饲料喂养畜牧或直接丢弃。通过测定发现，沙棘籽粕富含丰富的纤维素、半纤维素、蛋白质等营养成分，可以被微生物所利用，将其应用于微生物发酵领域具有潜在的应用价值。本课题将沙棘籽粕与红曲霉相结合，通过辅料的添加来达到生产Monacolin K 的目的，并通过改变发酵条件，探索发酵基质活性成分的变化趋势。本课题的成功实施有望降低生产成本，扩大红曲霉的底物发酵范围，为Monacolin K 的生产提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫色红曲霉菌株（Monascus Purpureus）M1：北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室保存；沙棘籽粕：青海康普生物科技股份有限公司；粳米、糯米：五常市彩桥米业有限公司；燕麦米：辽宁巨龙有机食品有限公司；薏仁米：朝阳泰然科技食品有限公司；芦丁、原花青素、牛血清蛋白：中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、盐酸、邻二氮菲：分析纯，北京化工厂；氯化钠、硫酸铜、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Monacolin K（纯度≥98%）；Sigma 公司。

BS2202S 型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DSHZ-300 恒温水浴振荡器：江苏省太仓市实验设备厂；RJ-LD-50C 低速大容量多管离心机：无锡瑞江分析仪器有限公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SCB-920 洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造公司；20A 型高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 辅料的筛选

以沙棘籽粕为主要发酵基质，以Monacolin K 含量和生长速度为指标，筛选出高产Monacolin K 的发酵辅料。

根据物料成分的特点，从粳米、糯米、薏仁米和燕麦米4 种常见稻米中筛选合适的辅料。配制发酵营养液（磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%），为发酵基质提供必要的矿物质元素。固定辅料与沙棘籽粕为1∶1（g/g），提前混匀后，在粗平底试管中进行生长速度的测定。以每管25 g 辅料来计算，分装在4 根大试管中，添加25 mL 营养液使含水量为50%。透气膜及报纸封口，121 ℃灭菌1 h。接种相同批次、相同大小的红曲霉固体培养基，记号笔标记发酵起点。一定时间后标记菌丝延伸长度，并记录发酵天数。

1.2.2 生长速度的测定

固定辅料与沙棘籽粕为1∶1（g/g），在粗平底试管中进行生长速度的测定。具体准备方法见1.2.1。待菌丝延伸至中间位置，记录生长天数及生长距离，计算生长速度。

1.2.3 Monacolin K 的提取及测定

将发酵结束的固体菌质于121 ℃灭菌1 h 后，取出置于45 ℃条件下烘干并粉碎。将1.00 g 干物质置于15 mL75%的甲醇中，超声 20 min，过 0.45 μm 滤膜，收集于液相小瓶中。

利用高效液相色谱进行Monacolin K 含量的测定。色谱条件如下，色谱柱 C18（5 μm，150 mm×4.6 mm），流动相为甲醇：0.1%磷酸=3∶1（体积比），柱温 30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。将标准品Monacolin K用无水甲醇配制成一系列浓度（5、20、50、80、100、150、200 μg/mL）溶液后进行测定，绘制浓度—峰面积标准曲线。样品以相同方法进行测定，所得峰面积带入标准曲线换算成含量。

1.2.4 不同辅料比例条件下水溶性和醇溶性活性成分的变化

固定含水量为60%，发酵时间为15 d，接种量为1 mL（孢子悬液浓度 3.2 × 104/mL），探讨沙棘籽粕/辅料为 1∶0、2∶1（1∶0.5）、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1（g/g）时，对水溶性成分和醇溶性成分含量的影响，以未接种的发酵基质为空白。

将发酵结束的固体菌质于121 ℃灭菌1 h 后，取出置于45 ℃条件下烘干并粉碎。取1.00 g 干物质以1∶8（g/mL）比例添加蒸馏水，90 ℃ 热水浸提 5 h。离心取上清液测定水溶性活性成分（总糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、总酚和黄酮）的含量。

1.2.5 不同含水量条件下水溶性和醇溶性活性成分的变化

固定沙棘籽粕/辅料比例（1∶1 g/g），发酵时间为15 d，接种量为1 mL（孢子悬液浓度3.2×104/mL），探讨不同含水量（40%、50%、60%、70%和80 %）对水溶性活性成分（总糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、总酚和黄酮）的影响，以未接种的发酵基质为空白。发酵后的菌质处理方式及上清液制备方法见1.2.4。

1.2.6 不同发酵时间水溶性和醇溶性活性成分的变化

固定含水量为60%，接种量为1 mL（孢子悬液浓度 3.2× 104/mL）和沙棘籽粕/辅料比例（1∶1 g/g），探讨不同发酵时间对水溶性活性成分（总糖和多肽）和醇溶性活性成分（原花青素、多酚和黄酮）的影响，以未接种的发酵基质为空白。发酵后的菌质处理方式及上清液制备方法见1.2.4。

1.2.7 活性成分的测定方法

水溶性活性成分总糖和多肽的测定方法参照参考文献[24]和[25]；醇溶性活性成分原花青素、黄酮和多酚含量的测定分别参照参考文献[26]、[24]、[27]。上述结果均以mg/g DW 表示。

1.2.8 数据处理及统计分析

试验数据利用SPSS 19.0 数据处理软件进行统计学处理，组间比较采用单因素ANOVA 分析，两两比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义，所得结果以±s 表示。

2 结果与分析

2.1 辅料的筛选

微生物生长需要必须的碳源、氮源、矿物质元素、生长因子等。沙棘籽粕纤维素、多肽含量丰富，可以为微生物提供必要的营养元素。预试验发现，单纯沙棘籽粕可以被红曲霉所利用，但是并不利于次级代谢产物Monacolin K 的积累，然而通过添加一定量的辅料有利于Monacolin K 的生成。图1为本试验所选4 种辅料的添加对Monacolin K 含量和菌丝生长速度的影响。

图1 添加不同辅料对生长速度和Monacolin K含量的影响Fig.1 Effects of different ingredients on growth rate and the content of Monacolin K

由图1可知，4 种辅料的添加均不影响菌丝的生长，其中，粳米、燕麦米和薏仁米的添加显著提高了菌丝生长速度（P＜0.01），糯米的添加与“无”辅料组的生长速度无显著差异（P＞0.05）。Monacolin K 含量因添加辅料而显著增加（P＜0.05），其中燕麦米的增加最为显著（P＜0.01），达到（1 836.88±128.58）μg/g DW。鉴于生长速度与特征性活性成分Monacolin K 的双重考量，选择燕麦米为后续试验辅料。

2.2 不同发酵条件对生长速度及Monacolin K含量的影响

为了明确不同发酵条件对生长速度和Monacolin K 的影响，本试验探讨了辅料比例、基质含水量和发酵时间3个重要因素对生长速度和Monacolin K 的影响，结果见图2。

图2 不同发酵条件对生长速度和Monacolin K含量的影响Fig.2 Effects of different conditions on growth rate and the content of Monacolin K

由图2A 可知，沙棘籽粕/燕麦米的比例影响了生长速度和Monacolin K 的含量，随着燕麦米所占比例的增大，Monacolin K 的含量呈上升趋势，由最初的（32.77±12.83）μg/g DW 升高至（2 972.18±15.66）μg/g DW，说明燕麦米有助于红曲霉次级代谢产物的积累；并且，随着燕麦米所占比例的增大，菌丝生长速度也存在着先升高后降低的趋势，追究原因可能是由于适量的燕麦米为红曲霉提供了丰富的单糖、双糖等，有助于红曲霉的直接利用，当燕麦米占据发酵基质的100%时，黏度的增加减少了基质中的氧气，不利于菌丝的分裂增长，生长速度下降。

图2B 探讨了含水量对生长速度和Monacolin K含量的影响。在所探讨试验范围内，60%含水量能够达到最大的生长速度（0.42±0.04）cm/d，Monacolin K 的积累量也达到最高（1 836.88±17.73）μg/g DW。本试验中，80%含水量使发酵菌质全部浸泡于发酵营养液中，发酵基质含氧量稀少，不利于红曲霉菌丝的延伸和次级代谢产物的积累。

Monacolin K 在发酵过程中的积累结果见图2C。随着发酵时间的延长，Monacolin K 的含量逐渐升高，并于第5天开始迅速积累，含量达到（460.15±17.72）μg/g DW，Monacolin K 含量在第17天达到最高，（2 418.53±86.20）μg/g DW，17 d～21 d 的积累量变化不显著。车鑫[28]在研究中药对固体发酵产Monacolin K 的影响研究中对照了普通发酵红曲的产量，发现红曲固体发酵产Mona colin K 的含量在1.5 mg/g DW 左右，显著低于本结果。

2.3 不同添加比例对活性成分含量的影响

设定沙棘籽粕/燕麦米的比例为 1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g/g）和 0∶1 7（g/g）个梯度，以未接种的灭菌基质为空白对照，观察不同比例下发酵15 d 后的终产物醇溶性和水溶性活性成分的变化，结果如图3所示。

图3 不同辅料比例对活性成分含量的影响Fig.3 Effects of ratios on the contents of active ingredients

随着燕麦米所占比例的增加，发酵前后原花青素的含量均呈下降趋势，且发酵后的样品组与空白对照组相比无显著性差异；总酚与黄酮的变化趋势类似，燕麦米的比例较大时，发酵后的总酚和黄酮含量显著高于发酵前；发酵前后总糖和多肽含量的变化趋势均随着燕麦米所占比例的增大而升高；同一辅料比例下，红曲霉的作用更有助于糖分和多肽的溶出，两者含量与发酵前相比总体呈升高趋势，但是在辅料比例2∶1（g/g）时，总糖的含量低于发酵前，原因可能是较低含量的燕麦米所含糖分刚好被红曲霉利用，且还没有利用基质中的纤维素类的原因。

2.4 不同含水量对活性成分含量的影响

不同含水量对活性成分含量的影响见图4。

含水量是微生物生长的关键因子，适量的含水量有助于微生物的生长繁殖和次级代谢产物的积累。固体基质中过高的含水量降低了基质的多孔结构，阻断的氧气的渗透；较低的含水量则不利于微生物的生长，限制了能量的传递和代谢产物的溶出。因80%含水量条件下，固体基质全部浸泡在发酵营养液中，微生物不能生长（图2B 所示），故在探讨微生物对基质中活性成分的影响时舍弃此条件。

图4 不同含水量对活性成分含量的影响Fig.4 Effects of different water contents on the contents of active ingredients

前期研究结果（图2B）显示，60%含水量下红曲霉的生长速度最大，低于60%含水量时，随着含水量的增加，微生物逐渐快速生长，体内各种分解酶活力升高，使基质中醇溶性物质原花青素、总酚和黄酮均低于发酵前；高于60%含水量时，微生物不能正常生长，使得部分活性物质（原花青素、总酚、黄酮和多肽）得以保留；发酵后的总糖含量在40%含水量时高于发酵前含量，可能是红曲霉分解了纤维素类屏障类物质使糖分溶出的结果，而在50%～70%含水量范围内均低于发酵前，可能是因为微生物的快速生长导致溶出的糖分进一步被利用。

2.5 不同发酵时间对活性成分含量的影响

本试验探讨了醇溶性和水溶性活性成分随发酵时间的变化趋势，结果见图5。

由图5可知，原花青素和总酚含量均在发酵初始时含量最高，随着发酵时间的延长而呈下降趋势，说明在微生物的生长过程中不利于两者的保留；黄酮含量呈现先上升后降低的趋势，并于第15天时达到最高，（1.00±0.07）mg/g DW，该趋势的呈现可能是由于在发酵前期微生物逐渐分解纤维素等屏障性物质，使黄酮更易溶出，随着发酵的延长，被微生物进一步利用的缘故；总糖含量的变化趋势与黄酮略有相反，发酵初期因微生物的生长消耗糖分，使总糖含量逐渐降低，随着发酵延长，微生物逐渐分解纤维素类等屏障性物质而产生供其利用的糖分，从而使总糖含量逐渐升高，当微生物数量逐渐增多到一定程度，微生物的消耗与微生物菌种本身的糖类达到动态平衡，而呈现最终趋于平缓的趋势。

图5 发酵时间对活性成分含量的影响Fig.5 Effects of fermentation time on the contents of active ingredients

3 结论

红曲霉可以直接利用沙棘籽粕进行生长繁殖，但是单纯沙棘籽粕并不利于Monacolin K 的积累；以菌丝生长速度和Monacolin K 含量为指标进行辅料的筛选，发现燕麦米是两者兼顾的最优辅料。当沙棘籽粕/燕麦米为 1∶4（g/g）时，菌丝生长速度最大（0.69±0.02）cm/d，且Monacolin K 随着燕麦米所占比例的增大而呈上升趋势；60%含水量下，菌丝生长速度和Monacolin K 含量达到峰值；在所考察发酵进程中，Monacolin K 含量在 17 d 后达到最大值（2 418.53±86.20）μg/g DW。

在不同的发酵条件下，发酵菌质中活性成分的含量与微生物的生长状态紧密相关。极端环境下，微生物的生长受到限制，使基质中的活性成分得以保留，但同时也因微生物对基质的分解作用微弱，使活性成分不易被提取和检测到；适宜环境下，微生物的生长状态良好，基质中的活性成分（如糖分）被分解消耗，但同时也因微生物本身数量的增加使最终发酵菌质中的活性成分含量升高。在每个发酵阶段，发酵菌质的活性物质含量此消彼长，均可大致归为上述原因。