Wnt7a蛋白在胃癌组织中的表达及其与预后的关系

刘博，赵建国，夏爱辉，唐晶，刘洋，李永峰，刘俊

（华中科技大学同济医学院附属协和医院 胃肠外科，湖北 武汉 430022）

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，在癌症相关病死率中排第3位[1-2]。胃癌患者在发现时往往已是晚期，导致预后不佳[3]。由Wnt家族分泌的糖蛋白触发的信号通路在进化上相对保守，参与细胞增殖、分化调控[4]。Wnt7a是Wnt家族的一员，广泛表达于人体各种器官，包括肺、睾丸、淋巴结和脑等[5]。Wnt7a与肿瘤的关系已有报道，如肿瘤细胞分泌的Wnt7a能招募并激活肿瘤相关成纤维细胞营造适合肿瘤生长的微环境，从而促进肿瘤生长及恶性进展[6]。Wnt7a能够激活Wnt信号通路，导致β-连环蛋白（β-catenin）入核增加，从而促进膀胱癌细胞侵袭转移[7]。在子宫内膜癌中，Wnt7a高表达于肿瘤组织中，并与临床分期、淋巴结转移和血管浸润等恶性表型密切相关，高表达Wnt7a的子宫内膜癌患者更易复发，生存预后更差[8]。与之相反，Wnt7a的抑癌功能在其他肿瘤中也有报道，如在雌激素受体阳性的乳腺癌中，多因素分析发现Wnt7a低表达与乳腺癌患者预后差相关[9]。然而，Wnt7a在胃癌中的表达及与临床病理参数间的关系并不清楚。本文通过检测Wnt7a在胃癌组织中的表达，分析Wnt7a表达与胃癌患者临床病理因素间的关系及对预后的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2009年1月—2014年12月在华中科技大学附属协和医院行胃癌根治术后标本135例，其中乳头状腺癌75例，管状腺癌45例，低分化腺癌15例。纳入标准：⑴ 术前未经放化疗治疗；⑵ 行胃癌根治性切除术，并经病理医师确诊；⑶ 有详细完整的病例及随访资料。剔除标准：⑴ 临床病例或随访资料不全者；⑵ 合并其他肿瘤者。随访时间截止至2018年3月，共得到胃癌标本135例，分别做成石蜡标本，并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 主要试剂

总蛋白提取试剂试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、特超敏ECL化学发光试剂盒、山羊抗小鼠HRP偶联标记的二抗、GAPDH小鼠抗人单克隆抗体均购于成都正能生物技术有限公司；Wnt7a小鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；即用型免疫组化MaxVisionTM试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 Western blot法

组织蛋白提取采用总蛋白提取试剂盒按说明书进行。按取0.1 g冻存的组织标本经研磨后加入0.5 mL裂解液（加蛋白酶抑制剂）行冰上裂解1 h，4 h液（加蛋白酶抑离心10 min），吸取上清得到总蛋白提取液。BCA法测定蛋白浓度，将样品作适当稀释后加20 μL到96孔板的样品孔中，各孔加入200 μL样品孔中，各工作液，37 ℃放置1 h。用酶标仪测定A562 nm吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。取30 µg蛋白样品加入等体积2×电泳加样缓冲液煮沸10 min。经10%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离，电泳转印到PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭30 min，加入一抗Wnt7a（1:300）或者GAPDH（1:500）4 ℃过夜孵育，PBST漂洗3次。室温孵育HRP标记的二抗（1:1 000）2 h，漂洗3次，采用ECL化学发光试剂盒显影蛋白条带。

1.4 免疫组化

免疫组化实验步骤按免疫组化试剂盒步骤进行。石蜡切片于65 ℃烘片2 h，二甲苯和酒精常规脱蜡至水。3%双氧水灭活内源性过氧化物酶30 min。柠檬酸钠缓冲液微波加热至沸腾抗原修复5 min，漂洗3次。5%山羊血清封闭30 min后去除多余液体，加Wnt7a一抗（1:200）4 ℃孵育过夜，漂洗3次。加二抗（1:500）室温孵育1 h，漂洗3次。DAB显色试剂显色，当目标蛋白出现棕黄色时自来水终止反应，苏木素复染细胞核。根据显色深浅及阳性细胞百分比分级，Wnt7a表达强度采用组织学评分（阳性细胞百分比：0为没有细胞显色或阳性细胞百分数＜5%；1为5%～35%细胞显色；2为36%～65%细胞显色；3代表＞66%细胞显色。表细胞染色强度：0为不显色；1为浅黄色；2为棕黄色；3为深褐色。总分≥深分为高表达组，＜5分为低表达组）。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件。实验数据以均数±标准差（±s）表示，统计处理采用独立t检验对组间进行比较；计数资料采用χ2检验。患者总生存率和无瘤生存率均采用Kaplan-Meier分析，单因素和多因素分析采用Cox回归模型，统计显著性以P＜0.05为标准。

2 结 果

2.1 Western blot检测结果

Western blot结果显示，胃癌组织中的Wnt7a蛋白表达量在明显高于癌旁组织（图1）。

图1 Western blot检测Wnt7a蛋白表达Figure 1 Determination of Wnt7a protein expression by Western blot

2.2 免疫组化检测结果

Wnt7a低表达于癌旁组织中，染色强度较浅（图2A）；Wnt7a在胃癌组织中染色强度深，同时在胃癌组织中Wnt7a的表达也存在差异，部分胃癌组织中低表达Wnt7a（图2B），部分胃癌组织高表达Wnt7a，染色强度深，主要定位在细胞质，胞外也着色（图2C）。胃癌组织Wnt7a低表达40例（29.6%），高表达95例（70.4%）， 癌旁组织Wnt7a低表达130例（96.3%），高表达5例（3.7%），两者差异有统计学意义（χ2=30.5，P=0.00）。

图2 免疫组化检测Wnt7a蛋白表达（×100）Figure 2 Immunohistochemical staining for Wnt7a protein expressions (×100)

2.3 Wnt7a表达与胃癌患者临床病理特征的关系

统计分析结果显示，Wnt7a表达水平与胃癌患者性别、年龄、HP感染、分化程度和Lauren分型无明显关系（均P＞0.05），而与胃癌患者TNM分期、远处转移和淋巴结转移明显有关（均P＜0.05）（表1）。

表1 Wnt7a表达与胃癌患者临床病理因素的关系Table 1 The relations of Wnt7a expression with clinicopathologic characteristics in gastric cancer patients

图3 Wnt7a高低表达组与低表达组生存曲线Figure 3 The survival curves of groups of Wnt7a high and low expression

2.4 Wnt7a表达水平与胃癌患者无瘤生存率和总生存率的关系

Wnt7a高表达组1年无瘤生存率为70.5%，Wnt7a低表达组为83.6%；Wnt7a高表达组5年无瘤生存率为3.6%，Wnt7a低表达组为47.4%，Wnt7a高表达组1、5年无瘤生存率低于Wnt7a低表达组（均P＜0.01）（图3A）；Wnt7a高表达组1年总生存率为78.1%，Wnt7a低表达组为85.1%；Wnt7a高表达组5年总生存率为17.2%，Wnt7a低表达组为60.9%，Wnt7a高表达组1、5年总生存率低于Wnt7a低表达组（均P＜0.01）（图3B）。

2.5 影响胃癌患者无瘤生存率的危险因素

单因素分析示：TNM分期（P=0.01）、远处转移（P＜0.01）、淋巴结转移（P=0.04）及Wnt7a表达（P=0.02）为影响胃癌患者无瘤生存率的因 素，多因素分析示：远处转移（P=0.02）及Wnt7a表达（P=0.01）为影响胃癌患者无瘤生存率的独立危险因素（表2）。

2.6 影响胃癌患者总生存率的危险因素分析

单因素分析示：TNM分期（P=0.04）、远处转移（P＜0.01）及Wnt7a表达（P＜0.01）为影响胃癌患者总生存率的因素，多因素分析示：TNM分期（P=0.03）、远处转移（P＜0.01）及Wnt7a表达（P=0.02）为影响胃癌患者总生存率的独立危险因素（表3）。

表2 单因素及多因素分析胃癌患者无瘤生存相关危险因素Table 2 The risk factors for disease-free survival analyzed by univariate and multivariate analyses

表3 单因素及多因素分析胃癌患者总生存相关危险因素Table 3 The risk factors for overall survival analyzed by univariate and multivariate analyses

3 讨 论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，每年约有100万例新胃癌病例被确诊，约70万例死亡，占全球癌症相关病死率的10%，已经构成严重的公共卫生安全问题[2]。胃癌的无进展生存和预后高度依赖于胃癌的早期诊断，其高病死率与缺乏标准筛查和早期症状缺乏相关。因此，胃癌早期诊断生物标志物的鉴定对治疗胃癌至关重要。

Wnt信号通路家族成员是由WNT基因编码一类高度保守的分泌型糖蛋白，通过与卷曲受体结合，调控细胞死亡、增殖、分化[10]。Wnt7a已被证实在多种生物学过程中发挥重要作用，如再生[11]、干细胞扩增[12]及恶性转变[13]等。Wnt7a在不同肿瘤中的表达状态存在较大差异。在子宫内膜癌中发现Wnt7a与肿瘤患者的总生存时间和无瘤生存时间显著相关，单因素和多因素分析发现，Wnt7a的表达可作为预测子宫内膜癌患者预后和复发的风险因子[8]。在卵巢癌研究中发现，相对于癌旁组织，Wnt7a在卵巢癌组织中高表达，并与患者预后差相关[14]。在结肠癌中，Wnt7a高表达于结肠癌组织中，并与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期相关。Wnt7a高表达的肿瘤患者无瘤生存时间和总生存时间更短[15]。除了Wnt7a所为癌基因有文献报道外，其作为抑癌基因也有文献报道。如在宫颈癌组织和细胞系中，Wnt7a呈低表达状态[16]。Bikkavilli 等[17]在转基因鼠中发现，小鼠肺癌发病率升高，主要由于Wnt7a缺失表达。在白血病中[18]，发现Wnt7a在白血病中低表达，高表达Wnt7a的T淋巴细胞能够抑制白血病细胞增殖，说明Wnt7a具有抑制肿瘤的功能。在肾细胞癌[19]中，88%的Wnt7a呈低表达状态，且过表达Wnt7a可抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成能力。在本研究中，胃癌组织Wnt7a高表达。结合临床病理因素分析发现，Wnt7a高表达与TNM分期、远处及淋巴结转移显著相关，这与之前在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中的报道一致。生存分析发现，Wnt7a高表达的胃癌患者更易复发，生存时间更短。多因素分析提示Wnt7a的表达状态可作为预测患者预后的独立危险因素。

当然，本研究仅限于分析胃癌患者临床病理因素与Wnt7a表达水平的关系，对机制并未作深入研究。Wnt7a在不同肿瘤中表达状态存在差异，在机制研究方面，在宫颈癌组织和细胞系中，Wnt7a下调表达的原因是由于其启动子中CpG岛的甲基化所致[16]。结合已有的报道，肿瘤中低表达的原因可能是由于表观遗传修饰调控，比如启动子DNA的甲基化、mRNA被微小RNA降解等，从而导致细胞衰老和凋亡不受调控，进而促进肿瘤发生发展[18]。Wnt7a作为抑癌基因的机制方面，Bikkavilli等[17]发现，Wnt7a通过失活调控细胞衰老的重要调控因子S期蛋白激酶相关蛋白2的活性，从而调控细胞正常衰老和凋亡，一旦WNT7A的表达量异常降低，这一过程被干扰，细胞衰老和凋亡减少，进而导致小鼠肺癌的发生。Wnt7a作为癌基因的机制方面，King等[20]发现成纤维细胞生长因子1作为Wnt7a/β-catenin信号通路下游的直接靶分子促进肿瘤的发生。本研究发现Wnt7a的高表达与胃癌的转移显著相关。笔者推测Wnt7a可能参与了胃癌的侵袭转移。结合之前的报道，上皮间质转化在胃癌的侵袭转移中发挥重要作用，而Wnt7a/β-catenin信号通路能够促进胃癌上皮间质转化发生，从而促进胃癌转移[21-23]。因此，推测Wnt7a上调表达可能通过促进胃癌上皮间质转化转化，导致胃癌的远处转移。

综上，Wnt7a在胃癌组织中高表达，并与患者恶性病理特征和预后差相关。Wnt7a的表达可作为判断胃癌患者预后不良的独立危险因子。诚然，本研究也存在一定的不足，比如Wnt7a在细胞系中的结果如何，与胃癌侵袭转移的具体分子作用机制还有待后续深入研究。