接受常规体外受精、卵胞浆内单精子注射者囊胚培养及妊娠结局对比观察

刘文婷,杨菁

(武汉大学人民医院生殖中心,武汉430060)

体外受精是指在体外环境中将成熟卵子和精子在人工控制环境下相互作用并结合成受精卵的过程。根据精子和卵子孵育时间以及精子进入卵子内部方式可将体外受精分为常规体外受精、短时体外受精、ICSI授精以及补救ICSI授精等。目前最常见体外受精方式为常规体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)。国内已有学者对两种受精方式的囊胚形成率及妊娠结局进行了比较，认为在同样的选择性囊胚培养纳入标准下,相比于ICSI,接受IVF者囊胚形成率和胚胎利用率更高[1],但由于没有考虑到IVF与ICSI两种受精方式在精液参数上存在明显差异，无法排除因精液参数的差异而导致不同受精方式囊胚培养结局的差异。本研究中，我们除了根据受精方式不同进行分组以外，并根据精液参数的不同将ICSI进一步分为正常精液与少弱精子精液亚组，比较不同受精方式的囊胚培养结局及冻融囊胚移植妊娠结局，以探讨不同受精方式对囊胚培养结局及妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2017年12月在湖北省妇幼保健院生殖中心接受常规体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)的女性受者1 230例。纳入标准:女方年龄≤35岁；可获取新鲜的卵子和精液者；囊胚培养第3天(D3)可利用胚胎数≥6(可利用胚胎为卵裂球数目≥4,且碎片≤25%)且未行胚胎冷冻；冻融周期囊胚移植者。排除标准:卵巢功能异常者；精液来源于附睾穿刺取精和睾丸穿刺取精者；行新鲜周期囊胚移植者。按受精方式不同分为IVF组994例、ICSI组236例，ICSI组按照精液参数的不同分为ICSI正常精液组90例、ICSI少弱精组146例。IVF组平均年龄29.27岁、平均不孕年限2.92年、平均获卵数20.24个、平均囊胚移植数1.86个、平均治疗周期数1.13个、平均BMI 25.56 kg/m2、平均基础卵泡刺激激素(FSH)6.12 IU/L，ICSI少弱精组组平均年龄29.11岁、平均不孕年限3.04年、平均获卵数21.89个、平均囊胚移植数1.83.个、平均治疗周期数1.16个、平均BMI 1.93 g/m2、平均FSH 5.88 IU/L，ICSI正常精液组平均年龄30.38岁、平均不孕年限3.02年、平均获卵数18.22个、平均囊胚移植数1.81个、平均治疗周期数1.24个、平均BMI 22.14 kg/m2、平均FSH 6.14 IU/L。三组年龄、获卵数、囊胚移植数、治疗周期数、不孕年限、BMI以及基础FSH比较无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 卵子、精子的提取及体外受精 卵子的提取:当患者一半以上卵泡直径≥14 mm时，于当晚注射重组HCG，36 h后阴道超声引导下 取卵。精子的提取:入选患者均禁欲3～7 d,收集手淫当日新鲜精液；IVF患者采用密度梯度离心法洗涤，后通过上游法收集上层精子，在授精皿中调至合适浓度待授精。ICSI组的显微注射均由高年资经验丰富的工作人员操作，排除因人员技术对胚胎发育的影响。ICSI少弱精患者因精子参数差为保证获得足够的精子，采用微量梯度离心法或直接离心法。ICSI正常精液组采用密度梯度离心法洗涤后，利用精子自身运动上游将活动的精子从精液中分离出来。授精:IVF组在HCG注射后39～40 h内完成授精，ICSI少弱精组和ICSI正常精液组取卵后3～4 h用80 IU/mL的透明质酸酶去除卵丘颗粒细胞，将排出第一极体的成熟卵子行ICSI。授精16～18 h，在光学显微镜下观察受精情况，出现双原核视为正常受精。根据Peter卵裂期胚胎评分标准评估D3胚胎质量,优胚为D1出现双原核，D2卵裂球数目2～5个，D3卵裂球数目≥6个且碎片≤10%。

1.3 囊胚培养及移植 将符合囊胚培养患者(年龄≤35岁；D3可利用胚胎数≥6)的胚胎采用序贯培养基(SAGE)进行囊胚培养至第5～6天，按Gardner囊胚分级系统对囊胚进行分级，然后冷冻囊胚。根据囊胚腔的大小和是否孵出将囊胚的发育分为6个时期:1期:早期有腔室囊胚，囊胚腔体积小于胚胎总体积的1/2；2期:囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2；3期:扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期:囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期:正在孵出，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期:孵出囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。处于3～6期的囊胚，还需对其内细胞团和滋养层细胞进行分级。内细胞团分级:A级:细胞数目多，排列紧密；B级:细胞数目少，排列松散；C级：细胞数目很少。滋养层分级:A级:上皮细胞层有较多的细胞组成，结构致密；B级:上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级:上皮细胞层由稀疏的细胞组成，大细胞很少。将D5或D6评分3AA、3BA、3AB、4AA、4BA、4AB的囊胚定义为优质囊胚。囊胚移植:采用玻璃化试剂(KITAZATO)解冻囊胚，冻融囊胚复苏后在囊胚培养液中培养至少2 h，能重新扩张成正常内细胞团和正常外滋养层形态的囊胚视为存活。将待移植囊胚移入移植皿，用培养液润洗移植内管，镜下不超过20 μL培养液装胚胎。由实验室工作人员将移植管移交给临床医生，在腹部B超引导下进行胚胎移植。对于移植囊胚后妊娠者给予黄体酮支持10～12周。

1.4 胚胎质量、囊胚培养及临床妊娠结局的观察 ①胚胎质量参数(包括正常受精率、卵裂率、优胚率):IVF正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵子数)/IVF加精卵子总数×100%;ICSI正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵子数)/注射MⅡ卵子总数×100%;卵裂率=D2卵裂胚胎数/正常受精卵子数；优胚率=优胚数/2PN卵裂数×100%。②囊胚培养结局(囊胚形成率、胚胎种植率):囊胚形成率=(D5/6总囊胚数)/正常受精卵子数×100%；胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%。③临床妊娠结局:临床妊娠率=妊娠周期数/移植周期数×100%。妊娠结局判定:囊胚移植14 d检测尿、血HCG阳性为生化妊娠，囊胚移植28 d B超见孕囊为临床妊娠。

2 结果

共纳入1 230个取卵周期，IVF组994个，ICSI组236个,其中ICSI正常精液组90个、ICSI少弱精组146个。

2.1 三组胚胎质量参数比较 三组正常受精率、卵裂率、优胚率比较，P均>0.05,见表1。排除D3养囊胚前因胚胎质量差异导致的囊胚形成率的差异。

表1 三组胚胎质量参数

2.2 三组囊胚培养结局及临床妊娠结局比较 IVF组囊胚形成率高于ICSI少弱精组和ICSI正常精液组(P均<0.01)；ICSI少弱精组和ICSI正常精液组囊胚形成率比较，P>0.05。三组胚胎种植率、临床妊娠率比较,P均>0.05,见表2。

表2 三组囊胚形成率、胚胎种植率及临床妊娠率

3 讨论

相比于ICSI，IVF的受精方式更接近自然受精过程，精子和卵子通过自然筛选和选择结合在一起，能与卵子自然结合的精子在DNA的完整性上优于不能与卵子结合的精子[2]。ICSI让男性不育症，特别少弱畸精症的患者或常规IVF不受精，或受精率很低的患者得到有效治疗，但是这种受精方式失去了自然选择过程。有研究[3]发现，ICSI授精显微镜下人为选择活力和形态学正常的精子在染色体和DNA碎片上也可能存在一定异常。也有研究[4]表明，精子DNA碎片与IVF/ICSI早期胚胎发育显著相关，精子DNA碎片越高、IVF/ICSI结局也越差。精子本身的缺陷有可能导致卵裂期胚胎在4-8细胞发育阶段以及囊胚发育阶段发育缓滞[5]。本研究中ICSI少弱畸精组和ICSI正常精液组优胚率、囊胚形成率、临床妊娠率及胚胎种植率差异均无统计学意义，提示在我们在现有的技术条件下行ICSI，通过显微镜挑选形态学正常的精子，可降低精液参数差异导致的胚胎发育障碍风险，但本研究也有自身的局限性，在纳入标准中能达到囊胚培养标准的患者，并未包含极端形态异常致无法挑选出正常形态精子的特殊患者。

囊胚培养是在适宜的培养条件下，延长体外胚胎培养至第5～6天的囊胚阶段。囊胚培养能筛选更有潜力的胚胎,且囊胚期移植与子宫内膜发育更同步、有更低的异位妊娠率、更好的抗冻能力以及有利于胚胎植入前遗传学诊断等诸多优势。已有研究[6～9]表明，囊胚培养可筛选出发育潜能较好的胚胎，且囊胚期移植更接近生殖内膜环境，显著提高了胚胎种植率。囊胚期移植的优势也很明显，选择高质量的囊胚进行移植可显著提高胚胎种植率及临床妊娠率。囊胚培养也有不足之处，要求条件高，有可能因为实验室培养条件或胚胎自身原因，胚胎停止发育或退化，导致没有胚胎可移植。由于体外培养环境终究不是体内自然环境，延长培养时间也可能使一部分能够着床的卵裂期胚胎退化。目前大多数生殖中心根据受者年龄、治疗周期数、受精数、获卵数和D3优胚数等指标以及自身意愿综合考虑是否进行囊胚培养，以提高囊胚形成率，但受精方式对于囊胚培养结局是否有影响还未有定论。汪彩珠等[1]研究报道，选择IVF授精方式的受者比选择ICSI授精方式的受者有更高的囊胚形成率。本研究结果显示，IVF组、ICSI正常精液组2PN受精率、卵裂率、优胚率、临床妊娠率及胚胎种植率均无统计学差异，但囊胚形成率却有统计学差异。提示，接受不同受精方式的受者囊胚形成率有差异，这个差异可能与体外不同受精方式的操作过程有关，具体原因考虑如下:ICSI操作会增加选择DNA受损精子和侵入外源性物质(PVP或者培养液)及垂直传递亲代遗传缺陷的风险[10～12]；ICSI在操作过程中对卵母细胞的微管、微丝系统和纺锤体可能产生机械损伤[13,14]；ICSI受精会增加超微结构异常及内部DNA微缺失的精子注入卵母细胞的风险，虽然这项操作并不影响卵子受精，但可能导致胚胎发育缓滞影响囊胚形成[15～17]；当精子DNA碎片率小于8%时，卵子可自行修复，但超过这个范围将会影响胚胎的发育潜能[18]。

总之，接受不同授精方式的受者囊胚形成率有差异，妊娠结局类似。至于授精方式对于囊胚培养结局及妊娠结局是否有影响，需要进一步进行多因素回归分析及更多的临床研究证实。