癫痫伴抑郁大鼠杏仁核脑源性神经营养因子及其受体酪氨酸激酶受体B的表达观察

杨钧哲,许新炜,朱含笑,程莉晶,李云

(1大理大学临床医学院,云南大理 671000;2大理大学第一附属医院)

癫痫伴发抑郁(EAD)是一种常见的神经精神疾病。癫痫是神经系统常见的疾病，抑郁是现代社会较为严重的精神问题。EAD发病率呈逐年递增趋势，癫痫发作程度及其所造成的损伤是导致抑郁发生的重要危险因素[1]。抑郁严重影响了癫痫患者的日常生活及社会功能，也给家庭及社会带来了沉重的经济负担。已有研究认为，癫痫和抑郁存在潜在共同发病机制，但其具体发病机制目前尚不清楚。因此，积极探索该病的发病机制及相关因素至关重要，对临床有效防治EAD具有重要意义。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经生长因子家族的重要成员，在中枢神经系统许多区域表达，通过与其特异性高亲和力受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)结合，发挥较强的促进神经细胞生长、分化、维持神经细胞存活和正常生理功能的作用[2]。BDNF及其受体TrkB参与损伤神经元的再生、发育，并参与突触重塑和神经递质传递的功能；BDNF能够影响成熟神经元的兴奋性，癫痫过程中BDNF水平明显上调，提示BDNF可能在癫痫发生机制中具有重要作用[2，3]。有研究发现，抗抑郁药物可以提高BDNF水平、促进神经元再生，并增加神经元突触的可塑性来发挥抗抑郁作用，改善抑郁患者的临床症状，提示BDNF及其受体TrkB在抑郁症的发生、发展及转归中发挥了不可替代的作用。本课题组前期的研究[3]发现，BDNF及其受体TrkB在脑卒中后抑郁发病中具有重要作用。现有研究提示，BDNF在癫痫及抑郁发病中均有作用，但其在EAD发病中的作用尚未见文献报道。2017年12月～2018年4月，我们观察了EAD大鼠杏仁核BDNF及其受体TrkB蛋白表达的变化，以探讨二者与EAD发病的关系。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康清洁级成年雌性SD大鼠52只，体质量(250±50)g,由昆明医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证：SYXK(滇)2005-0004。实验过程中对动物的处置符合大理大学第一附属医院关于使用实验动物的伦理学标准。Western blotting试剂：兔抗鼠β-actin 1∶1 500(一抗)、兔抗鼠抗体BDNF 1∶500(一抗)、兔抗鼠抗体TrkB 1∶1 000(一抗)、羊抗兔IgG抗体1∶500(第二抗),均购自CST公司；ECL试剂盒购自福建博特生物科技有限公司。免疫组化实验试剂BDNF及TrkB兔抗单克隆抗体购自Abcam公司；荧光二抗DylightTM594标记的羊抗兔IgG(发红色荧光)购自KPL公司。

1.2 动物分组及EAD模型建立、鉴定 采用Open-field法将健康成年SD大鼠52只随机分为对照组、癫痫组、抑郁组和EAD组，每组13只。抑郁组：采用慢性不可预见的中等应激刺激(CUMS)结合孤养法建立大鼠慢性应激抑郁模型。癫痫组采用文献[3]方法建立氯化锂-匹罗卡品癫痫模型，癫痫发作行为评分采用Racine评分标准：0级：未有任何反应；Ⅰ级：面部抽搐，包括节奏性咀嚼、动须等；Ⅱ级：在Ⅰ级的基础上加节律性点头动作；Ⅲ级：在Ⅱ级的基础上加前肢肌阵挛发作，但无后肢直立位；Ⅳ级：在Ⅲ级基础上加后肢直立位；Ⅴ级：全面性强直—阵挛发作，肢体失去控制。大鼠出现Ⅳ级以上的癫痫大发作为癫痫造模成功标准。于造模后第14天对癫痫模型进行抑郁筛选，EAD大鼠为EAD组，癫痫未伴抑郁者为癫痫组。EAD造模成功标准：大鼠出现Ⅳ级以上的发作时间大于60 min以上，大鼠毛发明显失去光泽，体质量减轻，蜷缩活动减少，自发活动和探究性活动减少，提示EAD模型建立成功。对照组：大鼠常规饲养。在造模成功后第1、8、15、29天，监测4组大鼠体质量、进行蔗糖水消耗实验及旷场实验进行抑郁行为评价。蔗糖水试验：各组大鼠在造模后第1、8、15、29天，每隔1周进行禁水24 h，测定禁水24 h后的第1 h内动物饮用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的饮用量反映了大鼠对奖赏的快感反应)。旷野试验：拟用敞箱长宽均为100 cm、高为50 cm，内空的立柱体，壁周为黑色，地面用黑线划分为面积相等的25块。以动物穿越地面方块数(四爪跨入)作为水平活动得分(反映大鼠的运动活动性水平)，以直立次数(两前肢离地1 cm以上)为垂直活动得分(反映其兴趣减少程度)。行为学评价结果显示：各组大鼠CUMS前、后不同时间体质量比较，EAD组、抑郁组与对照组、癫痫组相比较，在CUMS后第29天，肉眼观大鼠体型瘦弱，体毛失去光泽，蜷缩少动，快感缺乏，自发性探究活动减少。应激后不同时间各组大鼠体质量、蔗糖溶液消耗量、旷场实验水平运动距离及垂直运动距离比较大鼠体质量减少、蔗糖溶液消耗量降低、大鼠旷场实验水平运动距离、垂直运动距离缩短(P均<0.05);在CUMS后第29天，抑郁组、EAD组大鼠以上各指标较CUMS后1、8、15天降低(P均<0.05)，详见表1，进一步说明EAD模型建立成功。

1.3 各组大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白的检测 各组大鼠分别于造模成功后第29天取材，采用活体灌注取脑法取脑组织。①免疫荧光染色法检测杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每组取8只大鼠，用3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔麻醉，用生理盐水从左心室灌洗后，灌注4%多聚甲醛，断头取脑，于冠状面上切取大鼠大脑杏仁核0.5 cm，用冰冻石蜡切片机连续冠状切片，片厚8 μm，切片放于0.1 MPBS中浸泡固定24 h备用。按试剂盒说明书步骤操作，最后采用激光共聚焦微镜拍照，在每只动物杏仁核区选择高倍视野(HPF，400X)，计数BDNF和TrkB阳性细胞数量。②Western blotting法检测杏仁核BDNF及TrkB蛋白：每组取5只大鼠，麻醉后迅速活体取脑，根据大鼠解剖立体定向图谱于冠状位上切取0.5 cm厚的杏仁核约100 mg，置EP管中，-80 ℃冰箱保存。按试剂盒说明书步骤进行操作，最后计算条带的积分吸光度(IOD)值表示BDNF及TrkB蛋白相对表达量。

表1 各组大鼠不同时间体质量、蔗糖溶液消耗量、旷场实验水平运动距离及垂直运动距离比较

注：与对照组同时间比较，▲P<0.05；与癫痫组同时间比较，▽P<0.05。

2 结果

各组大鼠BDNF和TrkB阳性细胞发红色荧光，BDNF阳性产物定位在神经元胞质及突起根部，细胞核无染色；TrkB阳性细胞产物定位在神经元胞质，细胞核无染色。与对照组和癫痫组比较，EAD组大鼠杏仁核BDNF和TrkB阳性细胞数减少(P均<0.05)，见表1。与对照组和癫痫组相比，EAD组杏仁核BDNF及TrkB蛋白表达量减少(P均<0.05)，见表2。

3 讨论

杏仁核结构功能复杂、纤维联系广泛，参与了情感行为的形成、内分泌整合过程，其结构及功能改变与抑郁情绪的产生关系密切[4～6]。抑郁患者存在杏仁核容积缩小[4]，EAD模型大鼠杏仁核存在明显的神经元凋亡，可见杏仁核与EAD发生关系密切。近年研究发现，EAD的作用机制可能与神经突触可塑性异常有关。BDNF为一种重要的营养神经细胞的蛋白质，主要存在于海马、皮质下、杏仁核组织。BDNF对神经元的分化、修复以及再生具有重要作用，其可以通过与TrkB结合发挥生物学功能作用，如改善突触可塑性、使受损伤后神经元再生及参与认知、学习、情绪等方面的功能调节等。BDNF可长期调节中枢神经系统的突触可塑性：一方面，BDNF能增加Ras同源基因家族成员A(RhoA)蛋白水平,而RhoA可促进肌动蛋白细胞骨架的重组和树突蛋白的合成,调节突触可塑性[7]；另一方面,BDNF可调节海马神经元及突触中的蛋白酶体活性,从而使突触内的蛋白质处于相对平衡状态,以此来调节中枢神经系统突触可塑性[8]。TrkB是BDNF的高亲和力受体，广泛存在于神经系统中，参与神经元生长、发育过程，引起突触传递及可塑性调节。杏仁核中BDNF及其受体TrkB是否在EAD中发挥作用未见相关报道。

表1 各组大鼠杏仁核BDNF及TrkB阳性细胞数 比较(个/视野，

注：与对照组对比，aP<0.05；与癫痫组对比，bP<0.05。

表2 各组大鼠杏仁核BDNF及TrkB蛋白相对表达量 比较

注：与对照组对比，aP<0.05；与癫痫组对比，bP<0.05。

BDNF与抑郁症的发生存在着关联。研究[3]显示，抑郁症患者杏仁核中BDNF的高亲和力受体TrkB明显降低。动物实验结果[9]显示，TrkB激动剂可明显改善由脂多糖导致的大鼠海马区CA3结构区损伤、减少杏仁核p-TrkB表达、下调树突密度，从而发挥抗抑郁作用。郑蕾等[10]研究发现，母爱剥夺的成年大鼠海马和杏仁核BDNF及TrkB蛋白水平下降，导致了应激相关的抑郁症状发生。临床一线抗抑郁药物可以通过提高BDNF水平促进神经元再生，并增加神经元突触的可塑性来发挥治疗效果，从而改善患者的临床症状。本研究结果显示，与对照组比较，抑郁组及EAD组杏仁核BDNF及TrkB表达均低于对照组，抑郁组与EAD组BDNF、TrkB比较差异无统计学意义，提示在抑郁大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表达降低，且杏仁核BDNF、TrkB降低也可能提示EAD的发生。

BDNF及其受体TrkB在癫痫发病机制中发挥着重要作用。BDNF能使神经元产生兴奋，癫痫过程中BDNF水平明显升高[11]。在癫痫杏仁核结构中，颗粒细胞BDNF蛋白表达明显上调，而且BDNF受体TrkB蛋白表达也增加[12，13]。文献[14]报道，BDNF与苔癣纤维出芽(MFS)的关系密切，直接注射BDNF于成年大鼠脑内(海马、杏仁核、额前皮质等)可以诱发MFS，从而使大鼠出现癫痫样症状；癫痫可促使脑组织中苔藓纤维BDNF上调。通过过度刺激L型钙通道，可以引起颗粒细胞表达BDNF，激活TrkB受体可以引起脑内(海马、杏仁核、额前皮质等)MFS现象，从而诱发癫痫发作[15]。本研究结果显示，与对照组比较，癫痫组杏仁核BDNF、TrkB表达升高，EAD组杏仁核BDNF、TrkB表达降低，提示癫痫大鼠中杏仁核BDNF、TrkB表达升高，二者表达降低可能预示EAD的发生。

总之，与癫痫大鼠比较，EAD大鼠杏仁核BDNF及TrkB表达均降低，二者表达降低可能提示EAD发生。但本研究样本量少，后续研究需进一步扩大样本量，以进一步验证此结论。