白念珠菌ALS3、SSA1基因表达在念珠菌性阴道炎免疫机制中的作用

高盈 王琼 梁官钊 佘晓东 史冬梅，2 沈永年 苏晓红 李冬梅，3 刘维达

(1.中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤病与性病重点分子生物学实验室，南京 210042;2.济宁市第一人民医院皮肤科，济宁 272001;3.Department of Microbiology&Immunology, Georgetown University,Medical Center,Washington DC 20057,USA)

白念珠菌是女性生殖道的共生微生物，是外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis ，VVC)的最常见病原体，即使在免疫功能正常的个体中也可发病[1]。鉴于临床进展的差异以及感染部位的不同，人体阴道细胞抵抗白念珠菌病的机制在很大程度上仍然未知。

由Th1型CD4+T细胞介导的细胞免疫(Cell-mediated immunity ，CMI)被认为是抵抗白念珠菌感染的主要宿主防御机制[2]。然而，CMI并没有显示出对阴道念珠菌病的保护作用，因为复发性VVC的妇女仍然可以维持Th1型CMI的正常水平[3]。近年来的研究表明，上皮细胞在宿主对真菌的免疫、共生/病原体识别、损伤修复等反应中发挥着越来越重要的作用。处在黏膜最外表面的上皮细胞是最早接触病原体的宿主细胞，负责识别并启动对白念珠菌的免疫反应。其中，白念珠菌的毒力因子在黏膜念珠菌病的发病机制中也起重要作用，包括凝集素样序列3(agglutinin-like sequence3，ALS3)基因编码蛋白(Als3p)和压力相关蛋白-a1(Stress seventy related protein-al，SSA1)基因编码蛋白(Ssa1p)。Als3p是糖基化磷酯酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定的糖蛋白，负责白念珠菌黏附到上皮细胞，从而诱发免疫反应[4]。Ssa1p作为Hsp70家族的成员，分布在芽孢和菌丝表面，其作用与Als3p的作用类同，在与宿主细胞钙黏附素结合后导致病原菌内吞[5]。已有研究发现ALS3敲除株在感染口腔上皮细胞中，其GM-CSF、G-CSF、IL-6、IL-1a的表达量较空白对照组降低[6]。但检索中却很少见到研究Ssa1p在诱导上皮细胞产生细胞因子方面的工作。

为了更好地了解ALS3、SSA1基因对白念珠菌诱导阴道上皮细胞免疫反应的作用，我们在体外研究了白念珠菌野生株及基因缺失株分别感染上皮细胞时各项相关指标的差异，现报告道下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、菌株及主要材料

VK2/E6E7人阴道上皮细胞系由美国Raina Fichorova博士馈赠，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，使用添加50 μg/mL牛垂体提取物和0.1 ng/mL表皮生长因子的角质形成细胞无血清培养基(keratinocyte serum-free medium，KSFM，Gibco，USA)传代培养。白念珠菌SC5314作为本实验标准株(后文称为WT)，购自美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Center, ATCC)，其ALS3基因缺失株(Δals3)、SSA1基因缺失株(Δssa1)均由卫生部医学微生物菌(毒)种保藏中心真菌中心保存并提供。实验使用前，白念珠菌细胞保存于新鲜液体YPD(1%酵母提取物、2%培酮、2%D-葡萄糖)培养基中，实验时使其在30℃下再进行2～4 h的对数相生长，经收集、清洗、计数后用于实验。主要设备： CO2细胞培养孵箱，HQ45A恒温摇床，光学显微镜，微分干涉差显微镜(DIC)，倒置显微镜，MPEG图像分析系统，全能酶标仪。主要试剂：4%台盼蓝溶液。Cyto Tox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒。人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA检测试剂盒，人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)ELISA检测试剂盒，人白介素-1α(IL-1α)ELISA检测试剂盒，人白介素-8(IL-8)ELISA检测试剂盒。

1.2 芽管形成实验

将SC5314(WT)、Δals3和Δssa1的孢子分别加入含1 mL KSFM的24孔板中，在含5%CO2细胞培养箱中37℃下培养2 h，观察芽管的形成。利用微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscopy， DIC)对每个实验进行8～10个视野的随机成像。采用MPEG图像分析系统(MShot Image Analysis System)对芽管长度进行测量。

1.3 不同白念珠菌对上皮细胞的损伤作用

将1×106个阴道上皮细胞接种于6孔板，以感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.01感染念珠菌孢子后共培养24 h，用0.2%台盼蓝液染色细胞并取图。

以MOI=0.01～1的比率分别共培养白念珠菌孢子及阴道上皮细胞，24 h后测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量，用以评估上皮细胞损伤程度。实验使用Cyto Tox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega，美国)进行。细胞损伤的计算公式如下：细胞毒性%=(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)×100%。

1.4 细胞因子及趋化因子的检测

处理上皮细胞成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105cells/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL，置 37℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜，使细胞贴壁成单层。分别加入MOI为0.01、0.1、1的白念珠菌孢子，置于37℃恒温箱中培养。24 h后吸取培养液，离心后以酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)实验步骤检测上清液中细胞因子(G-CSF、GM-CSF、IL-1α)、趋化因子(IL-8)的产生。结果用酶标仪在450 nm波长测定各孔的光密度(OD 值)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件。采用独立样本t检验或单因素方差分析对上述结果进行分析。

以用P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同菌株芽管长度的差异

与SC5314和Δals3相比，在KSFM培养基中37℃、5%CO2培养2 h后，Δssa1平均芽管长度为4.2±1.8 μm，与其他两个菌株相比减少约30%～40%(P<0.001)；Δals3芽管长度较WT无明显变化(见图1A)。然而，这两个突变体的芽管的形态都不能与野生型菌株(见图1B)区分开。

2.2 不同菌株对上皮细胞损伤的差异

用台盼蓝染色法直观评价菌株对上皮细胞的损伤。显微镜下，损伤的上皮细胞易于与野生型和突变型菌株的菌丝聚集分布(见图2A)，如我们在高倍镜下看到的(见图2B)。与野生型相比，Δssa1突变体在MOI=0.01、共孵育24 h后对阴道细胞的损伤力明显降低，死亡细胞明显较少(见图2A、B)，Δals3突变体感染较野生型无明显变化。

使用LDH测定法进一步评估不同菌株对上皮细胞的损伤能力。如图3A所示，无论感染哪种菌株，阴道细胞的细胞损伤都随着感染比率的增加而增加(P<0.05)。图3B中Δssa1突变体的细胞毒性作用小于野生型，且随着感染比率的增大其差异有更明显的统计学意义(P<0.05)。而相较于Δssa1，Δals3突变株在与WT同感染比率时，其对上皮细胞的细胞毒性反而略有增高(MOI=0.1、MOI=0.01时P<0.05)。

2.3 细胞因子及趋化因子的检测

在本研究预实验中，发现4种待测因子在WT感染上皮细胞时，因感染比率的不同其产生量也不尽相同，其中GM-CSF、IL-8在MOI=0.01时可诱导最大分泌量，而G-CSF、IL-1α的最大分泌量则分别出现在MOI=0.1、MOI=10的感染状态下。所以本实验中设定不同菌株以上述不同感染比率感染上皮细胞，待24 h后检测细胞促炎因子(G-CSF、GM-CSF、IL-1a)及趋化因子(IL-8)的产生情况。

图4A的结果表明，MOI=0.01时，WT及Δals3菌株均可诱导阴道上皮细胞产生一定量的GM-CSF，而Δssa1菌株几乎不诱导GM-CSF的产生，突变株诱导GM-CSF的能力均减弱，且差异有统计学意义(P<0.01)。图4B的结果表明，MOI=0.1时，WT及Δals3、Δssa1菌株均可诱导G-CSF，但突变株诱导GM-CSF的能力均减弱，且差异有统计学意义(P<0.05)。图4C、D的结果表明，MOI=1时，WT及Δals3、Δssa1菌株均可诱导IL-1α；MOI=0.01时，WT及Δals3、Δssa1菌株均可诱导IL-8，但突变株的诱导两种因子的能力均减弱，且差异有统计学意义(P<0.001)。

3 讨 论

黏膜上皮细胞是黏膜最外层的细胞，是抵御白念珠菌感染的第1道防线，在抗白念珠菌感染方面也发挥着不可或缺的作用。黏膜与白念珠菌接触诱导免疫的过程中，一个重要因素是上皮细胞的免疫活性。研究表明，上皮细胞可通过激活细胞免疫相关通路(如MAPK通路)及分泌多种炎性细胞因子及趋化因子，募集中性粒细胞、树突状细胞等到感染部位，直接或间接的增强黏膜抗念珠菌的能力[7]。念珠菌感染诱发免疫反应的另一个重要因素则与念珠菌的毒力因子等密切相关。如真菌胞壁上存在的黏附因子，其承担着真菌对宿主上皮细胞黏附的作用，此过程影响着真菌致病的后续环节，有着尤为重要的作用。其中较为重要的白念珠菌侵袭素是Als3蛋白[8,9]及Ssa1蛋白[9,10]。它们存在于白念珠菌孢子或菌丝态上，与白念珠菌对上皮细胞的黏附与诱导内吞功能有关。前期已有研究证明敲除ALS3可降低诱导口腔上皮细胞产生部分炎性细胞因子及炎性信号通路蛋白的表达[11]。但却很少有实验研究ALS3敲除对阴道上皮细胞诱导产生炎性细胞因子的影响，及可能涉及到的炎性通路。也很少有实验研究SSA1敲除对上皮细胞产生炎性细胞细胞因子的影响，及可能涉及到的炎性通路。且关于SSA1敲除对口腔或阴道上皮细胞产生炎性细胞细胞因子的影响及可能涉及到的炎性通路的研究也较为鲜见。为更好地理解白念珠菌对阴道上皮细胞的作用及其影响因素，我们进行了此项研究。

图1WT、Δals3、Δssa1芽管形成实验图2台盼蓝染色图3细胞损伤实验图4细胞因子检测

Fig.1The germ tubes formation ofC.albicanswild type and mutantsFig.2Cell damage stained by trypan blueFig.3The cytotoxicity infected by wild type and two mutants at different MOI for 24 hFig.4Activation of chemokines induced byC.albicanswild type and mutants.

白念珠菌与上皮细胞的相互作用包括黏附和侵袭，前者需要白念珠菌侵袭素如Als3p和Ssa1p进行宿主识别，而随后的侵袭是通过受体介导的上皮细胞内吞完成的。在吞噬的同时，白念珠菌可以分泌组织降解酶，如蛋白酶和磷脂酶来穿透上皮屏障。为了测试降解过程的结果，我们还检测了乳酸脱氢酶释放对上皮细胞的损伤。结果提示，相较于Als3p，Ssa1p更显著的影响了这一过程。

分别用WT株及敲除组感染上皮细胞，镜下观察Δals3菌落生成形态及台盼蓝染色后细胞的分布状态，都并无明显不同。由此可以得出，ALS基因的表达并不是唯一影响菌丝损伤细胞的因素；而SSA1基因的敲除很大程度上影响菌丝的生长延长，与其后实验结果中对细胞损伤能力的减弱及诱导产生细胞因子的减少相一致。这些结果表明Ssa1p对于阴道细胞的侵袭和损伤是必需的，但Als3p不一定是必需的。

在台盼蓝染色结果中，菌丝周围围绕着较多死亡细胞，表明菌丝形成及其主动侵袭能力参与了白念珠菌对上皮细胞的损伤。已有研究证明白念珠菌Ssa1p和Als3p可通过与上皮细胞上存在的E-钙黏蛋白受体结合，从而诱导真菌内吞。随着SSA1和ALS3突变体的宿主内吞作用减弱，它们对宿主细胞损伤的作用也不尽相同。我们发现，SSA1的缺失降低了白念珠菌的感染性，并导致阴道细胞的损伤也显著减少，而Δals3似乎产生与野生型类似的变化。这些结果也一定程度上提示了阴道上皮细胞防御机制与相应假定毒力因子之间的关系。

黏膜上皮细胞能够释放细胞因子以应对病原体感染[12，13]。本研究中探索的细胞因子是基于它们是重要的调节、促炎或趋化细胞因子而选择的。这些针对念珠菌感染的免疫细胞因子和趋化因子可用于募集和激活多种免疫细胞，包括中性粒细胞、树突状细胞等。其中GM-CSF、G-CSF均为集落刺激因子，可作用于骨髓造血干细胞，促进各种前体细胞分化成熟；刺激增强成熟的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞吞噬，并以刺激增强细胞毒活性等多种方式增强局部的免疫反应[7,14]。IL-1α属于促炎细胞因子家族，通常保留在细胞中，但在激活时释放到体外，主要作用于白细胞和内皮细胞上的整合素表达[15]。IL-8的释放可以募集和激活中性粒细胞到黏膜感染部位[16]，从而触发适应性免疫应答。研究结果表明，与野生型相比，Δals3和Δssa1中细胞因子和趋化因子的表达均减少，其对细胞的损伤能力也相应降低，表明该两种基因与细胞因子应答及念珠菌的黏附和侵袭能力均密切相关，其机制可能与相关细胞因子诱发的炎性信号通路有关，具体机理仍需进一步研究。