Aga0917-PGEX-4T-2-BL21(DE3)plySs表达条件优化

王燕 马金 苏晓满 郝英慧

琼脂是一类以半乳糖为主要成分的一种高分子多糖，琼脂酶可将琼胶水解，产生的低聚糖具有重要的生理学性质和生物学活性，益于人类健康。在相关分子生物学实验当中，琼脂酶也可以从琼脂糖凝胶当中回收DNA、分离海藻中的原生质体和研究海藻细胞壁多糖结构和组成的工具酶。综上，琼胶酶具有十分广阔的研究发展前景。本实验主要探究Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs工程菌株发酵产酶的条件优化，以获得大量有活性的重组酶。

实验方法

生长曲线测定。挑取LB氨苄固体培养基上的Aga0917- PGEX- 4T- 2- BL21（DE3）plySs菌落，接种LB氨苄液体培养基，37℃、170rpm震荡培养12h，作为种子液。将种子液，按1：100的比例接种LB氨苄液体培养基，37℃、170rpm震荡培养，分别在培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h和13h时取出，以空白培养基为对照，测定600nm处的吸光值。每个时间点设置三个实验组。以培养时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制基因工程菌株的生长曲线。

琼胶酶酶活力测定。琼脂的α- 1，3和β- 1，4糖苷键可以被琼脂酶水解而产生还原性末端。在本实验中，我们主要利用DNS法测定琼胶酶活性，即D-半乳糖为标准，通过分光光度计测得的还原糖增量来定量琼脂酶活力。向具塞试管中加入1ml 0.1%琼脂糖底物酶，37℃水浴锅预热，再加入0.25ml粗酶液，37℃水浴30min，加入DNS 1.25ml，煮沸7min，取出冷却后加入2.5ml蒸馏水，混匀。相同条件下，以空白培养基代替粗酶液组为空白对照，测定OD540值。酶活力（U/ml）定义为，反应条件下，每ml反应液每分钟产生1μmol D-半乳糖所需酶量。

粗酶液制备。从固体培养基中刮取少量菌接种到加有Amp的种子液中震荡培养12h。将种子液以1：100的比例接入发酵瓶中，37℃、170rpm震荡培养2h，加入诱导剂IPTG，16℃、170rpm摇床中诱导培养16h。4℃、4000rpm离心10min收集菌体。加入5ml 20mM Tris- HCl（pH8.0）重悬。重悬完毕放于- 80℃冰箱冷冻30min。将解冻后的菌液进行细胞超声破碎（180W，7min），于4℃离心机12000rpm离心30min。收集上清即为粗酶液。

IPTG浓度对菌株产酶酶活性的影响。诱导剂IPTG设置0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mM 七个浓度梯度。根据1.3部分的描述，制备粗酶液。根据1.2部分的描述测定各组的酶活力。

种龄的影响。种子液培养时间设置2h、3h、5h、7h、12h和24h 六个水平。根据1.3部分的描述，制备粗酶液。根据1.2部分的描述测定各组的酶活力。

诱导时机对酶活性的影响。加诱导剂前的培养时间设置2h、4h、6h、8h與10h 五个水平。根据1.3部分的描述，制备粗酶液。根据1.2部分的描述测定各组的酶活力。

诱导时间与温度的影响。诱导时间设置8h、16h、24h和36h 四个水平，诱导温度设置12℃、16℃、25℃和37℃四个水平。根据1.3部分的描述，制备粗酶液。根据1.2部分的描述测定各组的酶活力。

实验结果与分析

生长曲线的测定

如图1所示，在2h- 8h时间段为该菌株的对数生长期，8h之后进入稳定期。因检测其吸光值只能检测到菌体数量的多少，而分辨不出菌体的活性，故在稳定期过后仍然显示吸光值增加，即在衰退期仍表现出吸光值的增加。在9、10h数值呈现下降趋势，其原因可能是测量时误差造成。

IPTG浓度对酶活性的影响

如图2所示，经DNS法测得当浓度为0.01mol/L的IPTG时，OD540值最大，换算为相对酶活力，在该浓度下的酶活力最高。在误差棒标注下，0.005mol/L的IPTG组存在误差，其可能因为测量时为完全混合均匀，或在酶与底物反应时，实验组加入酶的时间不同，导致酶与底物反应时间不同。

种龄对酶活性的影响

如图3所示，种子液培养时间为2- 7h 间，酶活力随种子液培养时间，有所上升，5h之后趋势变缓，在7h处达到最大，相对酶活力显示在12h- 24h处数值有下降趋势。

诱导时机对酶活性的影响

如图4所示，诱导前培养时间在2- 6h阶段较为平稳且酶活最大，6h之后开始呈现下降趋势。

诱导时间和温度对酶活性的影响

如图5所示，诱导时间为8h时，随温度的升高相对酶活缓缓上升，在25- 37℃之间酶活略有降低，但趋势平缓；诱导时间为16h时，随温度的升高，相对酶活呈先下降后上升再下降的趋势，12- 16℃下降趋势平缓，16- 25℃上升明显，且在25℃时相对酶活最高；诱导时间为24h时，整体呈缓缓下降的趋势；诱导时间为36h时，在12- 25℃呈平缓趋势，在25℃之后，呈较为明显的下降趋势。

诱导温度为12℃时，培养16h酶活最好；诱导温度为16℃时，培养16h酶活最高，8h次之；诱导温度为25℃时，培养16h酶活最大，8h次之；诱导温度为37℃时，培养时间为8h酶活最好。

综上所述，当诱导培养时间确定时，选择25℃培养最为适宜；当诱导培养温度确定时且在25℃以下时，选择诱导培养16h最为合适。当诱导培养温度确定时且在25℃以上时，选择诱导培养8h最合适。

基金项目：1.本研究由河南省科技计划项目《碳水化合物结合结构域（CBM）对琼胶酶Aga0917催化效率的影响》（编号：182102311134）

2.河南省教育厅《河南省高校省级大学生创新创业训练计划》（项目编号：201810472018）共同资助完成。

作者简介：

王燕（1982-），女，汉族，山东聊城人，副教授，新乡医学院生命科学技术学院，博士，研究方向：微生物酶资源；马金（1998-），女，汉族，河南南阳人，新乡医学院生命科学技术学院2017级本科在读，研究方向：微生物；苏晓满（1999-），女，汉族，河南洛阳人，新乡医学院生命科学技术学院2017级本科在读，研究方向：微生物酶资源；郝英慧（1999-），女，汉族，河南焦作人，新乡医学院生命科学技术学院2017级本科在读，研究方向：微生物酶资源。