TIAM1蛋白在神经母细胞瘤中的表达及临床意义

聂红艳，邱艳丽，靳 燕，曹嫣娜，闫 杰，李 杰，王景福，赵 强

（天津医科大学肿瘤医院儿童肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

T淋巴瘤侵袭转移蛋白（T-lymphoma invasion and metastasis 1，TIAM1）基因，即 TIAM1 基因，是一种鸟苷酸转换因子（GEF），为Rho家族中Rac1特异激活剂，参与细胞骨架活动，以及细胞迁移、粘附和侵袭、癌变和转移等[1]。有文献表明，TIAM1促进癌细胞的侵袭和转移，例如：在食管癌[2]，肝癌[3],宫颈癌[4]，甲状腺癌[5]等疾病中。而在结直肠癌中，有研究者提出其具有抑癌的作用[6]。有学者对106例原发性神经母细胞瘤组织进行二代测序发现，具有TIAM1基因变异者，其预后更好。认为可将TIAM抑制剂与常规疗法相联合，来改善患者预后[7]。然而，Cao等[8]对33例神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）组织进行靶向捕获的二代测序发现1例TIAM1基因缺失，该患者组织经HE染色为NB分化差型。因此，TIAM1是促进NB发生和转移还是具有抗癌作用，仍需进一步探索。本研究通过免疫组化的方法检测NB组织中TIAM1的表达，探讨其是否与NB的发生发展相关。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2010-2015年就诊于我院病理诊断明确、肿瘤标本保存完好、治疗规律，随访资料完整的病例61例，其中节细胞神经瘤9例，NB52例。根据INSS分期标准，NB的例数为：1期9例，2期6例，3期12例，4期24例，4S期1例。定义1、2及4S期为低分期（低危组）15例，3、4期为高分期（中-高危组）37例。年龄大于18个月者35例，小于18个月者17例；起源于颈、腹部者38例，胸、盆腔者14例；初治时肿瘤大小≤6 cm者26例，＞6 cm者26例；低分化者31例，高分化者21例。采用门诊、电话随访，统计终点为复发，死亡或随访终点，末次随访时间为2017年9月1日，随访时间为4～74个月，中位随访时间为33个月，截至随访结束时，死亡6例。

1.2 免疫组化染色 免疫组化通用试剂盒PV-6000操作说明进行，简要步骤如下：切片脱蜡水化；枸橼酸抗原修复；内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min；滴加TIAM1一抗（abcam），4℃过夜，室温复温后，滴加酶标山羊抗小鼠/兔IgG复合物，37℃，20 min；DAB显色，苏木素复染、盐酸酒精返红、氨水返蓝，脱水、透明、封片。

1.3 结果判读 对上述61例患者石蜡切片进行TIAM1免疫组化染色，至少2名专业儿童病理科医师，采用半定量分级法评分对染色结果做出判断，根据呈阳性反应的细胞所占比例和反应强度进行综合评价。阳性表达表现为棕黄色颗粒。采用双盲法，用染色强度和同样物镜视野下的阳性细胞数乘积作为评分；染色强度分为四个等级：0分=无色；1分=浅黄色；2分=棕黄色；3分=棕褐色；阳性细胞数分四个等级为：1分=1%～10%；2分=11%～50%；3分=51%～75%；4分=76%～100%，两者的乘积作为评分数值，定义评分小于等于4分为低表达，评分大于4分为高表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行统计学分析，采用Log-rank χ2检验进行单因素分析，Kaplan-Meier法分析患者生存率，P＜0.05为差异有统计学意义。“*”代表P＜0.05,“**”代表P＜0.01。

2 结果

2.1 TIAM1在肿瘤组织中的表达 在NB组织中，TIAM1弱表达（评分≤4）16例，TIAM1强表达（评分＞4）36例。而在这9例节细胞神经瘤中8例为高表达，1例为低表达，阳性率为88.9%。TIAM1蛋白主要定位于细胞浆中，但也可表达在细胞核内[6]（图1），并且其表达与NB分化程度相关（χ2=4.493，P=0.034），分化程度越高的组织其表达越强。TIAM1 与年龄 （χ2=0.243，P=0.622），发病部位（χ2=0.043，P=0.835），初治时肿瘤大小（χ2=1.444，P=0.229），INSS 分期（χ2=0.843，P=0.358），危险度分组（χ2=1.926，P=0.165），转移（χ2=2.066，P=0.151），LDH 水平（χ2=0.222，P=0.638）无关（表 1）。

表1 TIAM1蛋白表达与NB患者临床病理指标之间的关系Tab 1 Relationship between the expression of TIAM1 protein and the clinical characteristics of patients with neuroblastoma

图1 免疫组化法检测神经母细胞瘤中TIAM1表达情况（IHC×200）Fig 1 The expression of TIAM1 in neuroblastoma（IHC×200）

2.2 生存分析 见图2。

图2 NB患者TIAM1阴性表达和阳性表达生存分析Fig 2 Survival analysis ofnegative and positive expression in TIAM1 in NB patients

3 讨论

神经母细胞瘤是儿童时期最常见的颅外实体肿瘤，全基因组相关研究（GWAS）发现，NB是一种复杂的遗传性疾病，其形成与等位基因的多态性相关，包括MYCN扩增、ALK突变，LIN28B基因多态性，ATRX基因组重排等[9]。而与NB发生或预后密切相关的基因，主要仍是MYCN扩增以及ALK突变[10]。研究表明，Aurora-A对MYCN蛋白表达具有促进作用[11],其过表达与预后不良神经母细胞瘤密切相关[12]。但对于Aurora-A抑制剂的研究现今主要仍在动物模型中，例如，有学者证实：在N-MYCN扩增的小鼠模型中，MLN8054和MLN8237这两种Aurora-A抑制剂，能促进肿瘤消退和延长小鼠生存期[13-14]。另一方面，克唑替尼作为ALK基因突变靶向药物在非小细胞肺癌得到广泛运用并取得显著疗效，但由于NB中存在ALK激活点突变，使其对克唑替尼存在敏感性差异，甚至于ALK中某些点突变会对其产生内源性耐药[15]。并且，MYCN扩增型约占NB的18%～38%，ALK突变主要存在于家族性神经母细胞瘤患者中[11，16]。因此，NB的治疗遇到瓶颈，需要发现新的基因、新的有效治疗手段来解决这一难题。

在神经系统的发育过程中，轴突生长是通过生长锥的延伸和迁移而发生的，而TIAM1正向调控生长锥中层脂膜和丝状伪足[17]，并且可通过激活Rac1、抑制Rho-GTP酶（Rac1促进轴突生长,而Rho激活导致突起回缩），影响轴突形成，促进神经元分化[18]。研究证实：TIAM1参与星形胶质细胞突起的极化生长，其缺失导致突起中微管细胞骨架紊乱[19]。同时，TIAM1不仅参与Reelin蛋白介导的施旺细胞的迁移[20]，还与多巴胺能神经元的分化和发育相关[21]。因此，可以得出TIAM1在神经系统发育中起着至关重要的作用。

神经母细胞瘤来源于原始神经嵴细胞，主要是因神经干细胞分化为神经节细胞和施旺细胞障碍，产生了其他未成熟的神经元细胞（神经母细胞、节细胞性神经母细胞）而导致NB的发生[22]。同时，NB是一种常见的具有自发性消退趋势的疾病，这种自发性消退与分化主要存在于低危患者以及4S期患者中[23]。研究发现：神经生长因子受体TrkA在低危型及4S期NB中呈高表达状态，且当肿瘤微环境存在NGF（神经生长因子）时，其可引起NB分化[24]。此外，TrkA还可增强由Ras介导的细胞变性所引起的NB自我消退效应[25]。

TrkA能促进Rac1活化使TIAM1活性增强。而TIAM1与Ras协同作用能介导NGF诱导的RAC1活化，产生RAC1依赖的信号级联，导致突起生长所需的细胞骨架重塑。因此，TIAM1可作为NGF依赖性突起生长的信号介导因子[26]。Trk受体可激活Ras-GTP酶，使其在神经元存活和分化中起关键作用。其中，TrkC受体酪氨酸激酶作用于NT3（神经营养因子-3），激活Rac1和cdc42促进施旺细胞迁移，而TIAM1为其中的关键介质[27]。综上所述，可以看出TIAM1在神经分化中具有重要作用，而这种作用极可能通过TrkA/Ras/Tiam1/Rac1这条通路实现。TrkA、Ras对NB分化起促进作用，因此，TIAM1作为Ras的下游效应分子以及Rac/Rho通路的调节者，其可能在NB分化中具有重要作用。

上述免疫组化验证了TIAM1与NB分化相关，且分化程度越高的组织表达越强（图1）。因此，可以推断出TIAM1参与并促进NB的分化，可以作为NB治疗的潜在靶点。但通过对这52例样本进行生存分析发现，TIAM1蛋白高表达与患者3年生存率无明显相关性（图2），这可能与样本量少有关，下一步需扩大样本量并进一步探讨TIAM1在NB分化中的作用并了解其是否能成为NB潜在治疗靶点。