黑根霉胞外多糖联合奥沙利铂对二甲肼诱导的大鼠结肠癌的抑制作用及对Survivin/caspase-3/caspase-7的影响

王颜天池，鹿 艳，韩 军，王国栋，袁平川，柳春燕，陈靠山

(1. 安徽省多糖药物工程技术研究中心，活性生物大分子研究安徽省重点实验室，皖南医学院药物研发中心，皖南医学院药学院，安徽 芜湖 241002；2. 山东大学生命科学学院，山东 青岛 266000)

结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一[1]。奥沙利铂(oxaliplatin)属于新型铂类抗癌药物，是目前临床治疗结肠癌的常用化疗药物[2]。研究表明，奥沙利铂抗肿瘤作用与其抑制生存素(Survivin)的表达有关[3]。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员之一[4]。Survivin可通过抑制caspase-3和caspase-7的活性，抑制肿瘤细胞的凋亡进程[5]，是肿瘤发生和发展的重要诱因。

真菌多糖具有抗肿瘤的生物活性，其中香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖等真菌多糖已应用于临床肿瘤治疗中[6]。黑根霉胞外多糖(exopolysaccharide fromRhizopusnigricans，EPS)是本课题组从黑根霉真菌发酵液中提取并分离纯化得到的一种活性多糖，分子质量为9 682 u，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖以摩尔比5.89 ∶3.64 ∶3.2 ∶1组成。前期研究发现，EPS可诱导人结肠癌HTC-116细胞凋亡[7]，并能明显抑制CT26荷瘤小鼠肿瘤的生长[8]。但EPS和奥沙利铂联合使用对肿瘤的抑制是否具有协同作用，尚不清楚。本研究以1，2-二甲肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)皮下注射建立大鼠结肠癌模型，研究EPS和奥沙利铂联用对结肠癌大鼠的作用，并进一步探讨EPS和奥沙利铂对结肠癌大鼠Survivin、caspase-3和caspase-7蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只♂Wistar大鼠，体质量80～100 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0006。实验过程中，所有大鼠均自由进食和饮水。

1.2 药物与试剂DMH和奥沙利铂(美国Sigma公司)；caspase-3、caspase-7、Survivin兔单克隆抗体(美国CST公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、苏木精-伊红(HE)染色相关试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；无水乙醇、二甲苯、中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 方法

1.3.1EPS的提取 将黑根霉孢子接种于马铃薯琼脂蔗糖(PDA)固体培养基中活化后，转接至马铃薯蔗糖(PDB)液体培养基中，在28 ℃、120 r·min-1条件下连续培养10 d。将发酵液过滤后，收集过滤液，并加入其3倍体积的95%乙醇静置过夜。收集沉淀，并用蒸馏水充分溶解，经大孔树脂脱色，Sevage法脱蛋白后，冷冻干燥得到黑根霉胞外粗多糖。之后经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析，SephadexG-100凝胶柱层析分离纯化后，得到EPS。

1.3.2DMH诱导大鼠结肠癌模型的建立 将40只Wistar大鼠，经过1周的适应性喂养，随机分为5组，每组8只。A：空白对照组；B：模型对照组；C：EPS治疗组；D：奥沙利铂治疗组；E：EPS+奥沙利铂治疗组。B～E组大鼠均由颈背部皮下注射DMH(30 mg·kg-1)，每周注射1次，连续15周，建立大鼠结肠癌模型[9]。空白对照组皮下注射相同剂量的生理盐水。C组从第2周开始灌胃EPS(150 mg·kg-1)，每天1次，到20周。D组从16周造模结束，开始将奥沙利铂(10 mg·kg-1)溶解于5%的葡萄糖溶液，腹腔注射给药，每周1次，共4次。E组给药过程同C、D组。A、B组给予灌胃、腹腔注射相同剂量的生理盐水和5%的葡萄糖溶液。

1.3.3实验动物的处理 实验第21周，禁食不禁水12 h后。腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠，腹主动脉取血，之后再取结肠组织。保存于-80 ℃冰箱。

1.4 检测指标和方法

1.4.1HE染色 将刚取出的新鲜结肠组织用4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，将石蜡切片依次置于苏木精染液染色，再放入伊红染液中染色。脱水、透明、中性树胶封片。显微镜下观察分析结肠组织的病理学变化。

1.4.2Western blot法检测结肠组织中Survivin、caspase-3、caspase-7的蛋白表达 取100 mg结肠组织，加800 μL RIPA裂解液，在冰上充分匀浆裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min后取上清，BCA试剂盒检测蛋白含量；上样，SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，加入一抗Survivin、caspase-3和caspase-7(1 ∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，加入对应的二抗，室温摇床孵育1 h，加入ECL发光剂曝光，显影、定影；结果用Image-Pro Plus软件统计分析每个条带灰度值。

1.4.3免疫组化检测结肠组织中Survivin、caspase-3、caspase-7的蛋白表达 将结肠组织石蜡切片依次进行抗原修复，阻断内源性过氧化物酶和血清封闭。加入一抗Survivin(1 ∶200)、caspase-3(1 ∶100)、caspase-7(1 ∶100)湿盒内4 ℃孵育过夜，加入对应的二抗，室温孵育1 h。DAB显色和苏木精复染后，依次脱水，透明，中性树胶封片。显微镜采集图像，应用Image-Pro Plus对图像进行分析。其中苏木精将细胞核染为蓝色，DAB显示的阳性表达为黄色至棕褐色。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织病理学观察如Fig 1所示，正常对照组可见结肠组织腺体排列整齐，无炎症细胞浸润，并含有大量杯状细胞(图中红色箭头所示的空泡状结构)。模型组可见结肠腺体排列紊乱，炎症细胞浸润严重，杯状细胞几乎消失，细胞层次增多且拥挤。EPS组和奥沙利铂组结肠腺体形态大小不规则，可见少量杯状细胞，炎症细胞浸润的程度降低。尤其是联合用药组，结肠结构明显较模型组更加完整。表明EPS可以改善结肠组织的损伤程度，同时联合奥沙利铂给药的效果更佳。

Fig 1 Pathological changes incolon tissues of rats(HE×400)

A:Control group;B:Model group;C:EPS group;D:Oxaliplatin group;E:EPS+oxaliplatin group.

2.2 EPS联合奥沙利铂对结肠组织中Survivin、caspase-3和caspase-7表达的影响由Fig 2可知，Survivin蛋白在模型组中的表达升高，而治疗组的表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比，治疗组中caspase-3和caspase-7的蛋白表达明显升高，且EPS和奥沙利铂联合给药组的蛋白表达最高(P<0.05)。实验结果表明，EPS和奥沙利铂可能通过抑制Survivin蛋白的表达，促进caspase-3和caspase-7蛋白的表达，从而抑制结肠癌的发生和发展，且联合用药的效果更明显。

同时，通过免疫组化的方法检测大鼠结肠组织中Survivin、caspase-3和caspase-7蛋白的阳性表达。由Fig 3可知，治疗组与模型组相比，Survivin蛋白的阳性表达明显降低，而caspase-3、caspase-7蛋白的阳性表达明显升高(P<0.01)。结果与Western blot结果一致。

3 讨论

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，并且发病率趋于年轻化[10]。奥沙利铂是第3代铂类抗癌药物，具有高效、不易耐药等特点，具有良好的抗肿瘤活性[11]。但由于奥沙利铂对血液、周围神经系统的毒性，严重影响患者的生活质量，限制了其在结肠癌治疗中的长期使用。所以，寻找有效且毒副作用低的辅助治疗癌症药物尤为重要。

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离得到的一种活性物质。近年来，其抗肿瘤作用成为学者们研究的重要方向。本课题组前期研究发现，EPS体外可明显抑制人结肠癌HTC-116细胞的增殖，对S180实体瘤和CT26结肠癌移植瘤小鼠有明显的抑制作用[7-8,12]。但EPS的作用机制还需要进一步研究。

本实验通过DMH诱导建立大鼠结肠癌模型，并同时给予EPS、奥沙利铂单用以及联合给药治疗，通过病理切片观察，可见EPS能明显改善结肠组织的损伤程度，同时联合给药具有协同抑制作用。为了进一步探讨EPS和奥沙利铂抑制大鼠结肠癌的作用机制,本研究检测了细胞凋亡相关蛋白Sur-vivin、capsase-3和caspase-7的表达。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，是目前发现的最强大的凋亡抑制因子。研究表明，Survivin在结肠癌、肺癌、乳腺癌、喉癌、子宫癌、胃癌以及血液系统癌症中均有明显高表达。因此，Survivin已经成为恶性肿瘤的一个潜在的早期预测因子。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)广泛存在于细胞中，在细胞凋亡的执行阶段起着至关重要的作用[13-14]。Survivin蛋白通过直接或间接抑制caspase-3和caspase-7的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的发生和发展。应用蛋白质印迹法和免疫组化法检测发现，EPS和奥沙利铂均可降低结肠癌大鼠体内Survivin蛋白的含量，并升高caspase-3和caspase-7蛋白的含量，从而促进肿瘤细胞的凋亡，且联合用药的效果更为明显。

Fig 2 Effect of EPS combined with oxaliplatin on Survivin, caspase-3 and caspase-7 expression in colon

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 3 Expression of Survivin, caspase-3 and caspase-7 proteins in colon tissues (×400)

综上所述，本研究表明EPS和奥沙利铂单独使用对大鼠结肠癌有明显的抑制作用，并且联合使用有良好的协同抑瘤作用，且都具有抑制Survivin蛋白的表达，激活caspase-3和caspase-7信号通路介导的细胞凋亡的作用。本研究为进一步将EPS用于结肠癌的辅助治疗提供了依据。