响应面法优化头孢菌素C发酵条件

李宁慧 李凌峰 金志华

(浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，宁波 315100)

头孢菌素类抗生素具有抗菌活性强、抗菌谱广、耐β-内酰胺酶、毒副作用小等优点，是临床治疗细菌性感染的重要药物[1]。迄今为止，头孢菌素类抗生素全球已上市了50多个品种，占抗感染药物市场的50%，是目前世界上销售额最大的抗生素之一[2]。我国自20世纪70年代生产第一代头孢菌素产品以来，已有40多种头孢菌类抗生素用于临床。而与全球市场中头孢菌素类抗生素销售额逐渐减缓的趋势不同，近年来国内头孢菌素类抗生素产品正处于快速增长期，销售额年增长率超过30%，超过了国内医药产品的平均增长速率，未来几年头孢菌素原料药可能会出现更大竞争[3-5]。因此，关于头孢菌素类抗生素发现、生产和应用的研究方兴未艾。

头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)是顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)的代谢产物。虽然CPC的抗菌活力低于青霉素G，但由于其毒性和过敏性较低，可作为合成7-氨基头孢烷酸的前体，生产多种低毒、广谱和高效的新型头孢菌素类抗生素。因此，不少学者对头孢菌素C的发酵条件研究，取得了显著的成果[6-10]。本课题组进行了头孢菌素C合成菌株的筛选研究，获得了一株高产头孢菌素C的顶头孢霉；由于该菌株的头孢菌素C产量显著高于已报道的菌株的产量，对该菌株产头孢菌素C的发酵条件进行了研究，以提高头孢菌素C的发酵产量，并丰富对顶头孢霉代谢和头孢菌素C发酵研究的认识，为深入揭示顶头孢霉中头孢菌素C的合成机理和调节机制提供信息[11]。

由于影响顶头孢霉发酵生产头孢菌素C的因素较多，为了不遗漏关键的因素，以及诸因素间可能的交互效应，同时为了提高研究的效率，在实验中采用了Plackett-Burman法和响应面方法进行了研究。Plackett-Burman实验(以下文中简称PB实验设计)，能从众多变量中快速筛选出重要的因素；响应面方法(response surface methodology,RSM)能将实验设计和数学建模综合起来，给出指标和因素的关系式，从而得到准确有效的实验结论[12]。近年来，PB实验设计、RSM等统计优化方法越来越受到重视，在各行业中得到广泛应用，尤其是微生物发酵条件优化的研究中[13-16]。本文从大量菌株中筛选出顶头孢霉高产菌株，采用响应面法对头孢菌素C液体发酵中的各因素进行考察及评价，在摇瓶中对头孢菌素C的发酵条件进行了优化，为后续放大培养提供了可靠依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)，实验室低温保存。

斜面培养基(g/L)：燕麦片24，麦芽糖10，酵母提取物1，琼脂粉20，Na2SO41，pH6.4。

一级种子培养基(g/L)：黄豆饼粉30，金枪鱼浸膏20，玉米浆7.5，蔗糖5，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

二级种子培养基(g/L)：工业花生饼粉28，黄豆饼粉28，金枪鱼浸膏20，玉米浆15，蔗糖25，葡萄糖10，CaCO35，豆油0.1，pH7.0。

发酵培养基(g/L)：工业花生饼粉24，金枪鱼浸膏20，玉米浆13，DL-蛋氨酸7，玉米粉20，果葡糖浆35，工业小麦面筋粉38，(NH4)2SO48，CaSO412，CaCO334，豆油0.1，pH7.2。

以上培养基1×105Pa灭菌30min。

1.2 实验方法

1.2.1 顶头孢霉菌的筛选

取1mL的10%甘油孢子悬浮液稀释，分别取稀释为10-1、10-2和10-3的菌悬液各0.1mL涂布于培养基平板，28℃培养3～4d至单菌落出现，菌落长到1～2mm，挑选白色、菌落直径大、隆起高、没有裂缝的单菌落接种一级种子培养液，在28℃，190r/min的摇床培养4d。取一级种子培养液，用生理盐水稀释10倍，然后取1mL，加入二级种子瓶中，摇床培养，转速：210r/min，培养温度：28℃，培养时间：4d。取2mL二级种子培养液，加入含1.5mL豆油和10mL的发酵培养基的摇瓶中，置于摇床培养，转速：280r/min，温度：28℃，培养7d。取发酵液测定头孢菌素含量，筛选高产菌株并保存备用。

1.2.2 头孢菌素C的液体发酵

将筛选得到的高产菌株经活化后，分别接种于一级、二级种子液中培养，取一定稀释倍数的二级种子液接种至经PB试验设计的液体发酵培养基中，于选定温度下，转速为280r/min的摇床培养7d后测定培养基中头孢菌素C含量。

1.2.3 头孢菌素C的浓度测定

采用HPLC法测定[6]。发酵液中头孢菌素的提取：用定性滤纸过滤发酵液，吸取1mL上清液，再加入4mL甲醇和5mL纯水，充分摇匀，再取1mL与稀释液与9mL纯水混合，摇匀后用0.22μm微孔过滤器过滤备用[11]。

1.3 头孢菌素C发酵培养基的优化

1.3.1 Plackett-Burman设计筛选重要影响因素

PB设计是一种二水平的实验设计方法，主要通过对每个因素取高低两个水平，即以“+”、“-”分析，低水平一般为原始水平，高水平一般为原始水平的1.5倍左右，但主要还是视具体实验情况而定。它以N次实验来考察最多N-1个变量，还应留足空项(或称虚拟变量)用于方差分析。在N次的PB实验中，每个变量的“高”、“低”水平分别出现N/2次，可计算出此因素的效应，当某个因素处于“高”、“低”水平时，其余因素均出现N/4次，其他因素的效用将正负抵消而消除。对结果进行多元线性回归分析，并通过F检验进行效应显著度的统计学检验[17]。本实验考察11个影响因素，余留4个空项，所以选用N=16的PB试验设计，如表1安排实验，各代号对应的实际变量“+”、“-”和水平相应的真实值见表2。

1.3.2 最陡坡试验

最陡坡法也叫最陡(速)上升法(method of steepest ascent)，是一种多因素试验的设计方法。首先用正交试验查找最陡坡，使各因素水平的变动幅度与各自效应的大小成比例；然后沿最陡方向即目标相应升高方向安排一批试验点，根据响应目标对该效应的敏感度确定步长，调节至实验指标最优化；最后以最优点为中心安排实验[18]，检验头孢菌素C发酵产量的最高区域。根据PB实验结论，安排最陡坡实验见表3。此法可明显减少实验次数，缩短实验周期。

1.3.3 中心复合试验

中心复合试验设计(central composite design,CCD)采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的模型[17]。通过最陡坡实验确定头孢菌素C发酵产量最高区域后，选用中心复合设计对数据进行统计分析，具体实验设计如表4，各因素及其水平见表5。利用Design-Expert 8.0软件对表4中数据拟合得到一个二阶数学模型，求解得到最高头孢菌素C产量最优化发酵条件，由三维响应面图直观显示出优化结果。

1.3.4 验证实验

对头孢菌素C产量的预测值进行实验验证，安排在该预测之下的最优发酵条件，比较真实值和预测值，确定优化结果。

2 结果与分析

2.1 顶头孢霉的筛选

从分离平板中选出了18个白色、隆起高、菌落直径大、没有裂缝的单菌落，编号1～18，将单菌落的一半准备接种到种子培养基中，另一半接种至斜面培养基上保藏菌种。

取对应的菌株编号转接到种子培养液中，再经一级、二级种子液培养后转接至发酵培养基中，发酵7d后取样测定头孢菌素C的含量。从甘油孢中筛选得到一株顶头孢霉高产菌G3-7，发酵液中的头孢菌素C含量达到32.59g/L。与已报道的多株产头孢菌素C的顶头孢霉相比，该菌株的头孢菌素C发酵产量较高[6-10]，表明该菌株在代谢性能、特别是头孢菌素C合成代谢途径方面，具有与已报道菌株不同的特征，具有重要的研究价值。

2.2 顶头孢霉液体发酵条件优化研究

表1 Plackett-Burman的实验与结果(N=16)Tab.1 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 16 trials

表2 Plackett-Burman设计各因素水平、效应Tab.2 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design

表3 最陡坡试验设计及结果Tab.3 Experimental design of steepest ascent and the corresponding results

表4 中心复合试验设计及其响应值Tab.4 Experimental design and the actual and predicted values of cephalosporin C by CCD

表5 中心复合设计因素变量及其水平Tab.5 Levels and code of variables for CCD

2.2.1 影响顶头孢霉液体发酵的重要因素

由表2中P值大小可知，金枪鱼浸膏和蛋氨酸浓度是对头孢菌素C发酵产量有显著影响的重要因素：前者存在显著的正效应，浓度需进一步增加；后者存在显著的负效应，当前使用浓度过高，应适当降低。玉米浆和花生饼粉浓度以及发酵温度也有一定的影响，而培养基中的其它成分，如果葡糖浆等的浓度以及pH值、装液量、接种量对发酵产量均无显著影响。这说明对于高产菌株G3-7发酵产生头孢菌素C的过程而言，金枪鱼浸膏和蛋氨酸是两种重要的营养要素。金枪鱼浸膏的主要成份是鱼蛋白酶解而成的短肽链，富含20多种氨基酸、多种B族维生素、有机微量矿物质、牛磺酸和不饱和脂肪酸等物质，不仅可以为菌株的生长和代谢提供氮源、维生素和不饱和脂肪等营养要素，而且其中的有机微量矿物质有助于提高菌体内相关代谢酶的活力，促进头孢菌素C合成途径的活力，进而有助于头孢菌素C的合成。本研究后期采用国内海产品加工厂废角料生产的鱼精膏代替进口金枪鱼浸膏，两者相比，头孢菌素C产量基本相当，但鱼精膏更加便宜。蛋氨酸在诱导头孢菌素C的合成过程中不仅是硫的供应者，还有一些其他重要作用，不能被其他化合物所取代，可能原因包括：1)诱导扩环酶，环化酶，ACV合成酶等；2)为合成头孢菌素C所需的半脫氨酸提供硫原子[19]。因此，在后续实验中，对培养基中金枪鱼浸膏和蛋氨酸的浓度进行了进一步的优化研究。

2.2.2 最陡坡试验

为了保证响应面实验的顺利进行，首先采用最陡坡实验法对金枪鱼浸膏和蛋氨酸浓度进行了搜索，以确定存在极值的区域。根据表2中这二因素的水平、效应值，确定其变化方向及步长进行最陡坡试验，实验设计及结果见表3。

显然，实验4的头孢菌素C产量最高，为35.91g/L。根据响应面CCD实验的设计原理，选取头孢菌素C液体发酵的最优发酵条件即第4组实验为中心点设计。

2.2.3 响应面法优化实验条件

根据最陡坡实验，响应面变量逼近最大产量区域，以最陡坡实验中的4号配方为中心点用中心复合法设计试验，设计成2因素5水平，表4是2因素的编码及取值，表5是试验设计及其响应值。

根据实验结果，利用Design-expert 8.0软件，二次多项式回归得到的二次经验模型为：头孢菌素C的产量(g/L)=35.82-0.11A+0.56B-0.71AB-1.99A2-0.54B2。

模型整体方差分析(表6)表明：F值为41.532，P＜0.001，说明模型是成立的，有统计学意义。模型决定系数为0.967，说明响应值的变化96.7%来源于所选因素，模型拟合良好。此外，方差分析中的变异系数、信噪比均反映数据合理，模型的可信度高，可重复性好，精确度高，能准确地反映实验结果。因此可以认为该经验模型可以用来预测头孢菌素C发酵产量。对拟合的方程求解得：当金枪鱼浸膏为34.32g/L、蛋氨酸为6.52g/L时，头孢菌素C的产量为35.99g/L。图1是金枪鱼浸膏和蛋氨酸影响头孢菌素C产量的响应面图及等高线。

在已有对顶头孢霉发酵制备头孢菌素C的研究中，研究者发现对发酵水平存在显著影响的关键因素为碳源、氮源和磷源等因素。虽然表2显示蛋氨酸浓度呈现负效应，但其原因在于培养基中添加的蛋氨酸浓度较高(10.5g/L)，因为在前期单因素优化研究中发现，添加蛋氨酸可以显著增加头孢菌素C的发酵水平。之所以在PB实验中蛋氨酸浓度过高，这可能与多因素之间的交互效应有关。经最陡坡实验和响应面方法建模，表明在培养基中添加6.5g/L的蛋氨酸有助于头孢菌素C的合成，与文献报道用量基本一致[19]。蛋氨酸的主要生理作用是提供一碳单位，参与核酸等多种物质的合成，并且具有抗氧化功能。因此，蛋氨酸有可能通过提供一碳单位的作用，参与头孢菌素C的合成或其调控，此外，蛋氨酸中还含有硫元素，这也可能是蛋氨酸影响头孢菌素C合成的一个原因。桑美纳等[7]在进行头孢菌素C补料发酵优化研究中，之所以选择硫酸铵而不是氨水，其原因在于前者不仅可以提供氮源，而且还能为CPC合成提供硫源。因此，蛋氨酸增加头孢菌素C发酵的产量的原因一方面可能与其提供的一碳单位有关，另一方面还与其提供的硫元素有关。但具体机制有待进一步研究。

表6 二次模型回归方程系数的方差分析Tab.6 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

图1 金枪鱼浸膏和蛋氨酸影响头孢菌素C产量的响应面图及等高线Fig.1 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the yield of cephalosporin C production

2.3 优化后发酵培养基结果检验

在此条件下验证该实验的可靠性，选择最优发酵条件，以此条件重复实验3次，头孢菌素C的平均产量为35.946g/L，与理论预测值较为接近，误差小于5%。验证证明该模型能较好地预测实际发酵情况，可应用于顶头孢霉发酵条件优化。优化后头孢菌素C的产量较优化前提高了10.4%。

3 结语

利用自然筛选的方法分离顶头孢霉菌的策略，分离得到一株高产头孢菌素C的菌株，在培养基中添加蛋氨酸可增加该菌株的头孢菌素C合成，产量达到32.59g/L。采用PB设计方法及响应面法相结合的实验设计方法对头孢菌素C液体发酵培养条件优化，优化后的发酵培养基配方为：金枪鱼浸膏34.32、DL-蛋氨酸6.52、花生饼粉24、玉米浆13、玉米粉20、果葡糖浆35、工业小麦面筋粉38、(NH4)2SO48、CaSO412、CaCO334、豆油0.1，pH7.2，在此条件下的头孢菌素C产量达到了35.99g/L。实验表明，响应面法对于缩短头孢菌素C液体发酵试验周期，减少实验次数都有很好的作用。此法求得回归方程精度高，可考察各因素间的交互作用，是研究初期优化加工条件、降低开发成本、提高产物产量等实际问题的一种有效办法。