超高效液相色谱-串联质谱同时检测白酒中7种甜味剂

白丽真，刘 伟，刘洪银，张 帆

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

白酒是中国特有的一种蒸馏酒，是以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，以粮谷为主要原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿和勾兑酿制而成的各类白酒。品质优良的白酒味道醇厚，且有绵甜之感，是因为白酒中含有多元醇、高级醇等甜味物质，这些物质是在白酒复杂特殊的酿造工艺和发酵过程中产生的。近年来，食品安全问题一直备受关注，尤其是食品添加剂引起的安全问题。现在不少白酒生产企业为了改善白酒风味，增加回甜感，在白酒中添加少量的甜味剂，既降低成本还能提高生产效率[1]。

甜味剂是指能赋予软饮料甜味的食品添加剂，按其化学结构和性质分为糖类和非糖类甜味剂。葡萄糖等糖类物质，因长期被人食用，且是重要的营养素，通常视为食品原料，在中国不作为食品添加剂。而非糖类的甜味剂分为天然甜味剂和人工合成甜味剂，因其甜度较高，热值很低，有些甚至不参与代谢过程[2]，被称为非营养型甜味剂，受到人们的广泛关注。天然甜味剂有甜菊糖苷、甘草等。人工合成甜味剂有糖精、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜等。

人工合成甜味剂虽不会被人体吸收，但长期摄入会对人体的代谢系统、神经系统等造成伤害[3-4]。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014中规定白酒中甜味剂不得检出[5]。市场抽查的白酒中可能检出的甜味剂有糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷等。

目前检测白酒中的甜味剂的方法较多，其中液相质谱快速、灵敏的特点使其在白酒的甜味剂检测中的应用越来越多[6-10]。本文建立了一种快速检测白酒中最常见的7种人工合成甜味剂（安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、纽甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷）的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-TQS）检测方法[11-16]。该方法前处理简单、进样时间短、结果准确，可直接用于白酒生产企业白酒日常监督检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：市售的清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒各2种，配制酒2种，某品牌苹果醋1种和某品牌碳酸饮料1种。

试剂及耗材：甲醇、乙腈（LC/MS级，Fisher）；甲酸（HPLC级，美国Waters公司）；实验用水为Milli-Q超纯水；7种甜味剂：糖精钠（含量97%，北京百灵威科技有限公司），三氯蔗糖（含量98%，北京百灵威科技有限公司），纽甜（含量98%，北京百灵威科技有限公司），甜蜜素（含量99%，北京百灵威科技有限公司），甜菊糖苷（含量80%，北京百灵威科技有限公司），阿斯巴甜（含量98%，北京百灵威科技有限公司），安赛蜜（含量99%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）。

仪器设备：超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC®，美国Waters公司)-串联四极杆质谱仪(ACQUITY®TQS，美国Waters公司)；Milli-Q Reference超纯水发生器(美国Millipore公司)；电热板（广州格丹纳仪器有限公司）；0.22 μm有机滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准液制备

分别称取一定量的糖精钠、安赛蜜、三氯蔗糖、纽甜、甜蜜素、甜菊糖苷和阿斯巴甜标准品于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至10 mL，配制成各甜味剂标准储备液。由于阿斯巴甜等在纯水中不稳定，易分解，配制时可加入少量乙酸调节pH4.3。标准液于4℃冰箱中保存。根据需要用超纯水逐级稀释至适当浓度的混合标准溶液。

1.2.2 样品前处理

白酒样品：准确吸取白酒样品10 mL于50 mL烧杯中，用电热板120℃蒸发去酒精后，用超纯水定容至10 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤，进液质检测。

其他样品：直接稀释至合适浓度，经0.22 μm有机滤膜过滤，进液质检测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温为 40 ℃；样品室温度为20℃；进样量：1 μL；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脱程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.51～6.5 min，10%A。

1.2.4 质谱条件

质谱仪选用电喷雾离子源，在负离子模式下检测，采用多反应监测模式(MRM)定量。毛细管电压分别为2.5 kV，锥孔电压为20 V，脱溶剂气和锥孔气流量分别设为800 L/h和50 L/h，脱溶剂气温度为

400℃。质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本实验采用了HSS T3色谱柱。根据7种甜味剂的极性特点，以及乙腈的强洗脱能力和较强毒性，最终确定用甲醇作为有机相。然后对比甲醇-水和甲醇-甲酸水溶液两种流动相体系，发现用0.1%甲酸水溶液作为水相流动相进样时，7种甜味剂的峰形和响应明显比用水做流动相更好，且稳定性更好。最终确定用甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相。

表1 7种甜味剂的质谱条件参数

图1 7种甜味剂的MRM色谱图

表2 7种甜味剂线性回归方程与相关系数

2.2 质谱条件的优化

本实验以电喷雾ESI源作为离子源，在负离子模式下，以直接进样的方式对7种甜味剂标准样品进行全扫描，找到其准分子离子峰，将其作为母离子，用惰性气体氩气轰击，得到二级谱图和相应的子离子。用MRM模式对选定的子离子进行质谱参数的优化，取丰度最强的子离子作为定量离子。表1为7种甜味剂的质谱条件参数。图1为7种甜味剂在优化的质谱和色谱条件下的MRM色谱图。

2.3 前处理方法的优化

由于白酒中含有较高浓度的乙醇，直接进样分析会影响甜味剂在色谱柱上的保留时间和峰形，影响检测结果的准确性，因此在进样分析前会对白酒样品进行前处理。本实验用加水稀释和蒸发去酒精两种方式分别进样对比，发现由于白酒样品的酒精度分为3个等级，高度酒和低度酒的稀释倍数成为影响样品检测结果的一个重要因素，且甜味剂作为白酒的安全指标，在白酒中的含量本来就很低，如果稀释倍数过高，会影响结果的准确性，因此本实验采用蒸发去酒精的方式处理样品。

2.4 线性范围、检出限和定量限

由于各个甜味剂在质谱上的响应有差异，经过优化，使它们的响应在同一个数量级。将配制好的混合标准溶液进行检测，绘制标准工作曲线。以目标组分的峰面积y对相应的质量浓度x绘制标准曲线，结果表明，所有的甜味剂均有较好的线性关系，以信噪比（S/N）为3确定检出限（LOD），以信噪比（S/N）为10确定定量限（LOQ），结果见表2。

2.5 精密度和回收率

用在空白样品中添加标准溶液的方法，选择某白酒酒样做7种甜味剂检测试验，7种甜味剂含量均为未检出，选择高、低两种浓度进行加标回收实验，各做6次平行实验，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。结果表明，白酒中7种待测物的回收率在91.8%～114%之间，RSD小于8%(表3)，方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。

表3 7种甜味剂回收率和精密度

2.6 实际样品的检测

用本检测方法对市售的清香型白酒、浓香型白酒、酱香型白酒各2种，配制酒2种，某品牌苹果醋1种和某品牌碳酸饮料1种进行检测，每个样品做2次平行实验，结果见表4。10个样品中，白酒和配制酒中甜味剂均未检出，苹果醋饮料中三氯蔗糖有检出，碳酸饮料中有3种甜味剂被检出，分别是安赛蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。从结果可以看出，甜味剂在饮料中有添加，有些饮料中添加的甜味剂不止一种，白酒中没有甜味剂检出。该方法操作简单，成本低，快速准确，可用于白酒生产企业日常监督检测。

表4 实际样品的检测 (μg/mL)

3 结论

研究建立了用超高效液相色谱-串联质谱同时对白酒中7种人工合成甜味剂含量快速测定和确证的方法，优化了前处理方法、色谱和质谱参数。该方法操作简便，与国标相比，前处理简单，节约成本，进样时间只有6.5 min，分离效率高，同时具有灵敏度高、选择性好、检出限低、结果准确的优点，方法的回收率和重现性能够满足白酒中7种甜味剂的日常监督检测。此方法也可用于检测其他液体样品中的甜味剂含量，为从源头上控制白酒中甜味剂的出现提供了技术支持[1]，具有较高的实用价值。