3,5-二硝基水杨酸法测定黄水中总糖的含量

宋娇娇，裴 斐，马 勇，朱 青，赵 祥

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

黄水是浓香型白酒主要的副产物，黄水中含有丰富的酸类、酯类、醇类等呈香呈味物质[1]，同时含有大量的糖和蛋白质等大分子物质，限制了黄水的应用[2]，通常将黄水经预处理后再利用，总糖含量是评价处理效果的标准之一。实验室常用的总糖检测方法是滴定法与比色法，滴定法对溶液中的总糖含量、滴定速度、滴定环境等都有要求，且个人操作上的习惯、熟练程度等都会对结果造成较大的影响[3]。黄水颜色一般为亮黄色、深黄色甚至黑色，也会干扰对滴定终点的判定。比色法常用的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法，但前两种方法用的硫酸腐蚀性较强，会造成一定的安全隐患[4]。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）是半微量定糖法，该方法操作简单、便捷，杂质干扰较少，便于批量测定，是一种常用的测糖方法[5]。该方法的原理是在碱性条件下还原糖将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成氨基，生成橘红色化合物，在一定的范围内，还原糖含量与颜色成正比[6]。本试验采用盐酸将黄水中的总糖水解成还原糖，利用DNS法在最适波长下进行检测，利用吸光值与还原糖之间的线性关系计算黄水中总糖含量[7]。本研究考察显色剂添加量、显色时间、显色温度对检测结果的影响，采用正交试验确定黄水总糖水解条件，并进行方法学考察，建立3,5-二硝基水杨酸测定黄水中总糖含量的方法，以期为黄水的预处理等应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄水，取自洋河酒厂浓香车间。

重蒸酚，上海一基实业有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、盐酸、氢氧化钠、无水亚硫酸钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

电热鼓风干燥箱，上海左乐仪器有限公司；纯水机，上海摩勒科学仪器有限公司；水浴锅，常州市亿能实验仪器厂；UV-6000PC型紫外/可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂的配制

DNS试剂的配制[8]：称取6.3 g 3,5-二硝基水杨酸溶于262 mL 2 mol/L的氢氧化钠溶液中。将此溶液与500 mL含182 g酒石酸钾钠的热水混合，再添加5 g重蒸酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解后定容至1000 mL，充分混匀，存于棕色瓶中，避光存放7 d后使用。

1 mg/mL葡萄糖标准溶液：精密称取已烘干的葡萄糖1 g，加纯水定容至1 L，充分摇匀备用。

1.2.2 检测条件优化[9]

（1）显色剂添加量对检测结果的影响

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖标准溶液，分别添加显色剂0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL，100℃水浴中显色反应10 min，自来水迅速冷却，纯水定容至25 mL，以空白为对照，在波长540 nm处检测吸光值。

（2）显色时间对检测结果的影响

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖标准溶液，添加显色剂5 mL，100℃水浴中分别选择显色反应时间1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min、19 min、21 min，自来水迅速冷却，纯水定容至25 mL，以空白为对照，在波长540 nm处检测吸光值。

（3）显色温度对检测结果的影响

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖标准溶液，添加显色剂5 mL，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中显色反应7 min，自来水迅速冷却，纯水定容至25 mL，以空白为对照，在波长540 nm处检测吸光值。

1.2.3 标准曲线的绘制

取6支25 mL比色管，分别添加0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL的1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，再添加纯水使总体积到1 mL，然后添加5.0 mL的DNS试剂，充分混合后在90℃中水浴7 min，取出后用自来水迅速冷却，加纯水至25 mL充分摇匀后静置。以不加葡萄糖反应液为对照，在540 nm处测定吸光值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4 黄水水解条件的优化

只有黄水中总糖充分水解，总糖含量检测结果才准确，影响黄水水解的主要条件有水解时间、盐酸浓度、盐酸添加量。本试验参考液态发酵成熟醪总糖水解方法[10]，选择水解温度100℃，以水解时间、盐酸浓度、盐酸添加量为变量，以吸光值为指标，采用3因素3水平，按L9（33）正交试验进行黄水水解条件的优化[11]，正交试验设计因素水平表见表1。

1.2.5 样品测定

表1 L9（33）正交试验因素水平表

取1 mL黄水水解液于25 mL容量瓶中，其他步骤同1.2.4，测定样品的吸光值，并根据标准曲线计算出黄水总糖含量。

黄水浓度(mg/mL)=样品浓度×稀释倍数。

1.2.6 方法学考查

（1）精密度试验

取同一组黄水按照1.2.3与1.2.5确定的检测条件和水解条件，在540 nm波长下连续测定6次吸光值。考查方法的精密度。

（2）重复性试验

取同一批黄水6份，按照1.2.3与1.2.5确定的检测条件和水解条件，在540 nm波长下测定吸光值。考查方法的重复性。

（3）稳定性试验

按照1.2.3与1.2.5确定的检测条件和水解条件，在540 nm波长下测定吸光值，在显色反应结束90 min内，每隔10 min测定1次。考查方法的稳定性。

（4）回收率试验

取同一黄水水解液，加入不同质量浓度的葡萄糖标准溶液，参照样品检测方法对回收率进行考查。

2 结果与分析

2.1 检测条件优化

2.1.1 显色剂添加量对检测结果的影响（图1）

图1 显色剂添加量对检测结果的影响

由图1可知，当显色剂添加量小于5 mL时，溶液吸光值随着显色剂添加量的增加而增大；当显色剂添加量大于5 mL时，溶液的吸光值基本无变化。考虑到节约资源，显色剂的最佳添加量为5 mL。

2.1.2 显色时间对检测结果的影响（图2）

由图2可知，随着显色时间的延长，吸光值呈现先增加后下降并趋于稳定的趋势，显色时间为7 min时，吸光值为最大值，因此选择显色时间7 min。

2.1.3 显色温度对检测结果的影响（图3）

由图3可知，显色温度对检测结果影响较大，当显色温度达到90℃后，吸光值趋于稳定，因此选择最佳显色温度为90℃。

图2 显色时间对检测结果的影响

图3 显色温度对检测结果的影响

2.2 葡萄糖标准曲线的绘制（图4）

图4 葡萄糖标准曲线

由图4可知，葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.6987x-0.0245，线性相关系数R2=0.9956，表明葡萄糖溶液在0～1.0 mg/mL浓度范围内与吸光值呈现良好的线性关系。

2.3 黄水水解条件的优化

采用3因素3水平正交试验设计对黄水总糖水解条件进行优化，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

由表2中的极差分析可知，RA＞RC＞RB，3个因素对黄水水解液吸光值的影响顺序依次为：水解时间（A）＞盐酸添加量（C）＞盐酸浓度（B）。由表3方差分析结果可知，水解时间对黄水水解液的吸光值影响显著（P＜0.05），其他因素对结果无显著性影响（P＞0.05）。根据正交试验结果与分析，水解最佳条件为A2B3C3，即水解时间30 min，盐酸浓度12 mol/L，盐酸添加量15 mL。

表2 正交试验设计与结果

表3 方差分析

2.4 方法学考查

2.4.1 精密度试验（表4）

表4 精密度试验结果

由表4可知，精密度试验结果相对标准偏差RSD值为0.82%＜2%，说明3,5-二硝基水杨酸法测定黄水总糖精密度良好。

2.4.2 重复性试验（表5）

由表5可知，重复性试验结果相对标准偏差RSD值为1.62%＜2%，说明3,5-二硝基水杨酸法测定黄水总糖重复性良好。

2.4.3 稳定性试验（表6）

表5 重复性试验结果

表6 稳定性试验结果

由表6可知，黄水总糖在0～90 min内吸光值基本稳定不变，相对标准偏差RSD值为1.62%＜2%，说明采用3,5-二硝基水杨酸法测定黄水总糖在90 min内稳定性良好。

2.4.4 回收率试验（表7）

由表7可知，黄水中添加葡萄糖标液检测回收率在94.60%～97.60%，RSD值均小于2%，证明该方法对总糖的回收性良好，该方法准确度良好。

3 结论

本研究对3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定黄水中总糖的检测条件和水解条件进行了优化，并进行了方法学考查，建立了DNS法测定黄水中总糖含量的方法。确定了3,5-二硝基水杨酸法检测黄水中总糖的检测条件为：显色剂添加量5 mL，显色时间7 min，显色温度90℃；黄水总糖水解条件为：水解时间30 min，盐酸浓度12 mol/L，盐酸添加量15 mL。该方法的精密度、重复性、稳定性良好（相对标准偏差RSD均小于2%），平均加标回收率94.60%～97.60%，RSD值均小于2%。表明该方法检测黄水中总糖准确、可靠、重现性好。该方法适用于黄水中总糖检测，可为黄水应用提供依据，也可为其他总糖的测定提供参考。

表7 回收率试验结果