CLEC4D、CARD9在炎症性肠病中的表达及其作用*

杜晓博 赵美华 马 娜 高 闯 杨贝贝 王丹丹 耿 丽 王许平 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科 吴阶平医学基金会中国炎症性肠病联盟河南省炎症性肠病中心(450014)

背景：C型凝集素结构域家族4成员D(CLEC4D)在系统性真菌感染中可诱导Th17细胞分化，调控IL-17A表达，目前国内外尚未见其在肠道免疫中是否发挥作用的报道。目的：探讨CLEC4D、CARD9在炎症性肠病(IBD)患者结肠组织中的表达情况及其临床意义。方法：收集2016年10月—2018年6月郑州大学第二附属医院收治的IBD患者48例，其中溃疡性结肠炎(UC)患者36例，克罗恩病(CD)患者12例，以30例结肠癌旁正常组织作为对照。采用免疫组化法检测结肠组织中CLEC4D和CARD9表达，并分析其与临床特征的相关性。结果：UC组、CD组结肠组织中CLEC4D和CARD9表达均显著高于对照组(P<0.05)，而UC组与CD组之间无明显差异(P>0.05)。UC组CLEC4D、CARD9表达与Mayo评分、Baron分级呈正相关(P<0.05)，CD组CLEC4D、CARD9表达与CDAI评分呈正相关(P<0.05)，与SES-CD评分无明显相关性(P>0.05)；IBD患者CLEC4D、CARD9表达与CRP呈正相关(P<0.05)，而与ESR无明显相关性(P>0.05)。结论：CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表达升高，且与患者病情密切相关，CLEC4D可能通过CARD9相关途径参与IBD的肠道免疫。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)，其是一种病因不明的慢性非特异性消化道炎症性疾病，目前认为肠道微生物、免疫功能异常在IBD的发生、发展中起有重要作用。肠道微生态包括细菌、真菌、病毒等，目前关于细菌在IBD中的研究较多，而相关真菌的研究较少[1]。现有研究表明无论是小鼠DSS结肠炎模型还是IBD患者，其肠道真菌数量和多态性均发生变化，表明真菌在IBD中发挥一定作用，但具体作用机制仍不清楚[2]。

C型凝集素(C-type lectins)是模式识别受体的重要组成部分，在抵御真菌感染、介导免疫炎症过程中起有重要作用[3]。C型凝集素结构域家族4成员D(C-type lectin domain family 4 member D, CLEC4D)是最近发现的C型凝集素家族成员，可特异性识别真菌细胞壁成分α-甘露聚糖，诱导Th17细胞分化，参与抗真菌反应[4]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9, CARD9)在真菌、分枝杆菌的先天性免疫中发挥作用。在C型凝集素介导的全身性真菌感染中，CARD9可将先天性免疫与Th17细胞分化联系起来，起关键的信号转导作用[5]。此外，CARD9的某些遗传变异可增加真菌感染风险。

目前CLEC4D、CARD9在人体胃肠道免疫中是否起作用仍不清楚。本研究通过检测IBD患者中CLEC4D、CARD9的表达情况，旨在探讨其在IBD中的作用及其可能的机制。

材料与方法

一、一般资料

收集2016年10月—2018年6月郑州大学第二附属医院门诊和住院IBD患者48例，其中UC患者36例，CD患者12例。IBD的诊断符合2018年中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制定的诊断标准[6]。48例IBD患者中，男性22例，女性26例；年龄15～69岁，平均(42.3±15.8)岁，且近4个月内未接受过激素、免疫抑制剂、生物制剂治疗，未合并其他自身免疫病。以同期30例行外科手术切除的结肠癌旁正常组织(距癌组织5 cm以上)作为对照，均经病理检查证实。其中男性17例，女性13例；年龄42～76岁，平均(52.2±12.2)岁。本研究方案通过郑州大学第二附属医院伦理委员会批准，入选者均签署知情同意书，。

二、方法

1. 免疫组化法检测结肠组织CLEC4D、CARD9表达：组织切片经脱蜡，梯度乙醇水化，抗原高压修复，抗原封闭，灭活内源性过氧化物酶，滴加兔抗人多克隆抗体CLEC4D (美国Abcam公司，稀释比例为1∶500)、CARD9(Cloud-Clone公司，稀释比例为1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜；滴加二抗，DAB显色；苏木素复染，分化，封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

结果判断：细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。高倍(×400)视野下，计数阳性细胞数，随机选取5个视野，取均值。每张切片由两名病理科医师分别计数，双盲下进行评分。阳性细胞百分比：0～5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色强度：无着色，0分；浅黄色，1分；棕黄色，2分；黄褐色，3分。染色总评分为阳性细胞百分比与染色强度之积，0分，阴性；1～4分，弱阳性；5～8分，阳性；9～12分，强阳性。

2. 疾病活动性、内镜表现评估：CD患者疾病活动性评估采用Best CD活动指数，内镜下表现评估采用SES-CD评分[7]；UC患者疾病活动性评估采用改良Mayo评分系统，内镜下表现采用Baron量表分级系统进行评估[8]；同时收集患者初次住院时的ESR、CRP。

三、统计学分析

结 果

一、患者的一般情况

36例UC患者中，CLEC4D弱阳性表达15例，阳性15例，强阳性6例；CARD9弱阳性表达9例，阳性21例，强阳性6例。12例CD患者中，CLEC4D弱阳性表达4例，阳性2例，强阳性6例；CARD9弱阳性表达2例，阳性6例，强阳性4例。各组患者疾病活动性评分、内镜下表现评分、ESR、CRP结果见表1。

二、各组结肠组织CLEC4D、CARD9表达情况

各组结肠组织CLEC4D、CRAD9表达情况见图1、图2。与对照组相比，UC、CD组CLEC4D、CARD9表达均显著升高(P<0.05)，而UC组与CD组之间相比无明显差异(P>0.05)(表2)。

三、CLEC4D、CARD9表达与患者临床特征关系

UC组CLEC4D、CARD9表达与Mayo评分呈正相关(r=0.331，P<0.05；r=0.379，P<0.05)，与Baron分级亦呈正相关(r=0.330，P<0.05；r=0.334，P<0.05)；CD组患者CLEC4D、CARD9表达与CDAI评分呈正相关(r=0.588，P<0.05；r=0.636，P<0.05)，与SES-CD评分无明显相关性(r=0.332，P>0.05；r=0.428，P>0.05)。

IBD患者CLEC4D、CARD9表达与CRP呈正相关(r=0.689，P<0.01；r=0.302，P=0.037)，而与ESR无明显相关性(r=0.376，P=0.137；r=0.282，P=0.060)。

表2 各组CLEC4D和CARD9评分比较

*与对照组比较，P<0.05

讨 论

IBD患者的肠道微生态发生了改变，其中真菌的改变主要表现为机会致病菌数量增多，主要包括念珠菌属、毛孢子菌属和酿酒酵母菌[9]。Jawhara等[10]的研究发现，给予DSS结肠炎小鼠白念珠菌灌胃后，肠道组织中髓过氧化物酶以及肿瘤坏死因子(TNF)-α增加，肠道炎症反应加重。Qiu等[11]给予DSS结肠炎小鼠氟康唑治疗后，体质量较对照组明显降低，结肠明显缩短。上述研究表明肠道真菌在IBD的发生、发展中起有重要作用，但其具体的作用机制楚尚未完全清楚。

CLEC4D、CARD9是机体抵抗真菌感染的关键分子。本研究结果显示，与对照组相比，UC、CD患者结肠组织中CLEC4D、CARD9表达均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示CLEC4D、CARD9可能在IBD的发生中起有作用。UC主要由Th2细胞引起，而CD主要与Th1细胞相关，两者的发病机制存在明显差异。目前认为Th17细胞和IL-17在IBD中起有重要的促炎作用。在系统性免疫中CLEC4D主要通过Syk-CARD9-Bcl-10通路，介导NF-κB诱导Th17细胞分化，从而发挥抗感染的作用[12]。Wang等[13]以DSS诱导CLEC4D缺陷小鼠结肠炎，结果显示与野生型小鼠相比，其炎症反应加重，肠道中热带念珠菌数量增加，Th17细胞减少，IL-17表达降低等。提示CLEC4D可能通过诱导Th17细胞分化和IL-17表达发挥作用。后续研究将检测IBD患者结肠组织或外周血中IL-17表达，并进一步分析其与CLEC4D、CARD9的关系，从而探讨CLEC4D可能的作用机制。

表1 CD和UC患者疾病活动性、内镜下评分、ESR和CRP结果

A：对照组；B：UC组；C：CD组

A：对照组；B：UC组；C：CD组

此外，本研究还发现，UC组CLEC4D、CARD9表达与Mayo评分、Baron分级呈正相关；CD组CLEC4D、CARD9表达与CDAI评分呈正相关，但与SES-CD评分无明显相关性。SES-CD评分系统主要根据CD患者结肠镜结果进行评估，而CD则可发生于整个消化道，同时部分患者存在因严重狭窄而结肠镜无法通过的情况，影响了SES-CD评分对CD患者总体状况的评估。但总体而言，CLEC4D表达与IBD患者病情严重程度呈明显正相关。

本研究还发现，IBD患者CLEC4D、CARD9表达与CRP呈正相关，而与ESR无明显相关性。虽然ESR和CRP是评估炎症程度的重要血清学指标，但既往研究发现与ESR相比，CRP能更好地反映中-重度IBD的活动性[14]，本研究中，中-重度UC、CD患者占84%，这可能是造成该结果的原因之一，同时也不能排除样本过少导致的实验误差。

综上所述，本研究发现CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表达升高，且与患者病情严重程度相关，CLEC4D可能通过CARD9相关途径参与IBD的肠道免疫，但机制仍不明确，应行进一步研究阐明其具体的作用方式。