慢性自发性荨麻疹患者外周血Th17 Trey及细胞因子水平变化的临床意义

罗浩杰 杨建强 孙慧 朱文华 连炜炜

慢性自发性荨麻疹（CSU）典型症状为皮肤瘙痒、 风团或红斑，其病程一般＞6周，1周发病＞2次或每天发生，给患者日常生活、学习或工作带来不良影响［1］。CSU发病机制尚未清楚，但较多文献认为CSU发病多与自身免疫有关，特别是细胞免疫失衡［2-3］。CD4+T细胞被认为在CSU发生、进展中发挥关键作用，初始CD4+T细胞不仅有Th1、Th2细胞，且还能分化辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）。Th17主要分泌白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）等因子，近年来有研究表明Th17/Treg细胞失衡为自身免疫性疾病发病关键，但关于Th17、Treg细胞比例及其相关细胞因子与CSU的关系报道尚少。本文分析Th17、Treg细胞及相关细胞因子水平在CSU患者中的变化，为CSU临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年1月至12月本院就诊的CSU患者120例。纳入标准：（1）符合CSU相关诊断标准［4］；（2）就诊前30d无免疫抑制剂、激素类药物干预史；（3）就诊前14d无组胺药物干预史；（4）性别不限，年龄＞18岁；（5）均接受血清相关指标测定；（6）相关资料完整。排除标准：（1）妊娠期或哺乳期妇女；（2）肝肾功能不全；（3）合并其他系统性疾病；（4）急性自发性荨麻疹；（5）资料不全者。其中活动期65例，静止期55例。选择同期性别、年龄相匹配的健康体检者50例为对照组，均无自身免疫性疾病、感染及肿瘤。CSU疾病活动评估标准［5］以CSU皮肤瘙痒、风团发生情况为依据，采取5等级评分法，0分表示无，4分表示重度；0分判断为静止期，1～4分判断为活动期。

1.2 方法 清晨空腹采集受检者肘静脉血6ml，按照要求规范处理后一部分用于Th17细胞、Treg细胞测定，另一部分用于血清细胞因子水平测定，均于本院实验室完成。通过贝克曼库尔特Gallios流式细胞仪测定Th17细胞、Treg细胞：（1）Th17细胞测定：肝素锂抗凝，RPMI 1640稀释，佛波酯4μl、离子霉素20μl、PMA 25μl滴入，37℃下孵育 240～360min。平均分成2管，分别加入CD3-PerCP 2.5μl、CD8-FITC 2.5μl，计为A管、B管，室内常温下孵育15min，加入固定液Reagent A 100μl，室内常温下放置15min；清晰后将溶血液Reagent B及破膜液加入这2管。之后A管内加入鼠IgGl-PE 2.5μl，B管内加入IL-17-PE 2.5μl，室内常温下放置15min，再次清晰，磷酸缓冲盐溶液（PBS）0.5ml重悬，流式细胞仪测定。（2）Treg细胞测定：Ficoll淋巴细胞分离液顺利获取外周血单个核细胞（PBMCs），不完全1640培养基洗涤2次，之后完全1640培养基（含有1%胎牛血清）重悬细胞，调节细胞浓度为1×106/ml，C4-FITC、CD25-PC5抗体10μl一起加入，4℃下孵育20min，PBS洗涤，加入固定/穿膜液400μl，室内常规温下放置40min，PBS再次洗涤，加入缓冲液800μl，室内常温下放置20min。重悬后均平均成2管，分别加入Foxp3-PE抗体、同型对照抗体，室温下孵育30min，PBS洗涤，PBS重悬，流式细胞仪测定。应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）、转化生长因子-β（TGF-β）水平，试剂盒购自上海润裕生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以%表示，用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，多组间行单因素方差分析，组间两两比较行LSD-t检验；Spearman相关性分析血清指标与症状评分的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 见表1。

表1 各组一般资料比较（x±s）

2.2 各组Th17、Treg细胞比例 见表2。

表2 各组外周血Th17、Treg细胞比例比较［%，（x±s）］

2.3 各组血清细胞因子变化 见表3。

表3 各组血清IL-17、IL-21、IL-35水平比较［ng/L，（x±s）］

2.4 相关性分析 Spearman相关性分析显示血清IL-17、IL-21水平与CSU症状评分呈正相关（P＜0.05），而TGF-β水平与CSU症状评分无相关（P＞0.05）。见表4。

表4 CSU症状评分与血清指标的相关性

3 讨论

CSU发病机制无明确定论，免疫球蛋白E结合于相应受体造成肥大细胞脱颗粒，促使组胺大量分泌释放，最终造成荨麻疹发生［6］。近年来发现T细胞亚群及对应因子异常在CSU发病、进展中发挥重要作用［7-8］。

Th17作为CD4+T细胞新型促炎细胞之一，起初在TGF-β作用下对RORγ表达，TGF-β、白介素-6（IL-6）共同影响，促进Th17β细胞分化，IL-21产生，经由自分泌对Th17深入分化、扩增。IL-17在Th17细胞中占据重要地位，包括IL-17A、IL-17F等指标。CD4+T细胞、巨噬细胞等多个细胞均可促IL-17产生，其中发挥主导作用的是CD4+T细胞［9］。IL-17除诱导IL-6等促炎因子产生、释放外，还能诱导人类B细胞分化，致使异常抗体产生，参与自身免疫反应。有研究表明Th17细胞经由分泌产生IL-17、IL-21等相关细胞因子，参与相关自身免疫性疾病、炎症反应过程［10］。石教启等［11］研究发现相比健康体检人员，急性荨麻疹患者血清IL-6、IL-17、TGF-β及转录因子维甲酸相关孤儿素受体γt（RORγt）mRNA水平均显著高。认为Th17细胞可能对IL-6、IL-17等促炎因子分泌以参与急性荨麻疹发病。Atwa等［12］发现CSU患者血清IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-23（IL-23）水平比健康人员显著高，且活动程度与上述血清因子正相关。本资料结果显示CSU活动期外周血Th17细胞比例、血清IL-17、IL-21水平比CSU静止期、对照组均显著高，而活动期与静止期比较无显著差异。提示Th17细胞及其相关因子IL-17、IL-21可能促CSU发生。同时本资料显示，血清IL-17、IL-21水平与症状评分呈正相关。认为血清IL-17、IL-21可作为CSU疾病活动评估有效指标。

Treg细胞也是CD4+T细胞亚群之一，于体内外对CD4+T、CD8+细胞增殖负性调节，对细胞免疫功能造成不同程度的影响，其表达与CSU发病有关［13］。TGF-β为小分子蛋白，有激素样活性特点，其分泌与Treg细胞密切相关，可促Treg细胞生成。TGF-β能经由自身调节作用对炎症反应影响，炎症刚开始时或TGF-β1含量不多时可将免疫激活，加重炎症反应，TGF-β1水平较高时则对相关炎症细胞分化抑制，阻断或减少炎症因子分泌产生，发挥免疫抑制作用。TGF-β被认为是Th17和Trg细胞连接的关键。本资料结果显示相比健康者、CSU静止期，CSU活动期外周血Treg细胞比例、血清TGF-β水平均显著低。提示CSU活动期Treg细胞比例、血清TGF-β水平降低，可能加重炎症反应。这可能与TGF-β1促Treg细胞分化作用有关，白介素-2（IL-2，与Treg细胞发育、扩增有关）表达高，提高TGF-β1诱导之特异性转录因子叉状头转录因子（Foxp3）表达，促Treg细胞，且对RORγt表达抑制，进而抑制Th17细胞分化［14］。关于TGF-β水平表达与石教启等［11］研究结果相反，这因TGF-β有双重作用，一方面高表达促IL-17分泌，诱导Th17细胞分化，另一方面高表达促Treg细胞表达。为此关于Th17、Treg细胞之间平衡与否及其两者失衡可否解释CSU发病机制仍需进一步研究。