益智仁缩尿功效成分的研究

冯惠敏 王周平 徐德平

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

益智为姜科山姜属(Alpinia)植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)的干燥成熟果实，又称益智仁或益智子，主要分布于中国海南、广东、广西等省份，是一种安全性高的药食两用植物资源。中医认为其具有温脾止泻摄唾，暖肾固精缩尿的功效，临床上用于治疗虚寒腹泻、遗尿等多种疾病[1-2]。药理研究表明该植物具有止泻、镇痛、镇静、强心、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗炎[3]、神经保护[4-6]等作用。益智仁含有丰富的化学成分，具有多种药理活性，近年来，中国越来越多的学者对益智仁缩尿功效进行了研究，并取得了新的进展。黄勤挽等[7-8]研究表明，将益智仁和食盐协同入药，可显著降低正常小鼠尿量。据龚晓猛等[9]报道，益智仁缩尿功效的药效部位为挥发油或石油醚提取部位，但关于益智仁缩尿功效的活性成分未见报道。基于此，本试验拟对益智仁缩尿功效的化学成分展开了系统研究，旨在阐明其药效物质基础，探究主要化学成分，为日后益智仁的研究和进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

益智仁：购于安徽亳州中药市场；

ICR小鼠，体质量18～22 g，雄性，上海斯莱克动物实验动物有限公司；

无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

柱层析硅胶：100 目，青岛海洋化工公司；

硅胶板：GF254，山东烟台芝罘化工厂；

Middle Chromatogram Osolated Gel(MCI GEL)填料：三菱化学有限公司；

Octadecylsily(ODS)填料：日本YMC公司；

试验用水为去离子水。

1.1.2 主要仪器设备

磨粉机：GLF-205型，浙江省温州市创立药材器械厂；

萃取罐：RAT-100型，无锡申科仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，江苏省金坛市荣华仪器厂；

旋转蒸发器：R-1002型，上海申顺生物科技有限公司仪器厂；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技术公司；

暗室紫外投射仪：ZF-90型，上海顾顺电光仪器厂；

可见分光光度计：WFJ 2000型，优尼柯上海仪器有限公司；

核磁共振仪：Avance 500 MHz型，布鲁克(北京)科技有限公司；

小鼠代谢笼：SA106型，江苏赛昂斯生物科技。

1.2 方法

1.2.1 益智仁提取物的制备 称取10 kg益智仁，粉碎后过80 目筛，按照料液比1∶10 (kg/L)加入75%的无水乙醇，置于100 L萃取罐中，50 ℃条件下搅拌提取3 h，过滤，取滤液减压浓缩[10]。滤渣按上述方法反复提取2次，合并3次提取液减压浓缩至适宜体积，即为益智仁乙醇提取物，并于-20 ℃ 条件下保存备用。按照上述提取方法，向益智仁醇提后滤渣中加入100 L去离子水，并于60 ℃ 条件下搅拌3 h，重复提取2次，过滤取滤液减压浓缩至浸膏状，即得益智仁水提物，冷冻保存备用。

取适量益智仁乙醇提取物于1 000 mL分液漏斗中，依次按照1∶1 (mL/mL)比例加入乙酸乙酯、正丁醇，小心倒置震荡，使其充分混匀，反复萃取3次，得到乙酸乙酯萃取物(A)、正丁醇萃取物(B)和萃取剩余相(C)，分别减压浓缩至油膏状，于-20 ℃条件下保存备用。按醇水比4∶1 (mL/mL)向水提物中缓慢加入无水乙醇，并不断搅拌使浓缩液充分醇沉，至酒精浓度达到70%以上，静置过夜，过滤得滤液相(D)减压浓缩至膏状，醇沉相(E)充分干燥，于-20 ℃冷冻保存备用。

1.2.2 益智仁不同组分缩尿活性

(1) 单纯水负荷小鼠模型建立：采用3周龄SPF级ICR雄性小鼠60只，体重18～22 g。适应性饲养1周后，观察小鼠状态，并随机分成6 组(分别为空白对照组K和试验组A、B、C、D、E)，每组10 只。经口给药，每天1 次，连续2周。经小鼠缩尿预试验，试验组灌胃剂量确定为1 g/(kg·d)，空白对照组给等体积饮用水。试验前18 h禁食不禁水，末次给药(或水)1 h后按0.6 mL/20 g体重灌胃纯水作为水负荷，充分挤尽膀胱内尿液[11]。

(2) 尿量收集：使用200 μL移液枪，收集代谢笼中每只小鼠的尿液，置于1.5 mL离心管中。准确称量并记录前2 h尿重及6 h总尿重后，于-20 ℃冷冻保存。

1.2.3 益智仁缩尿功效的成分分离及鉴定

(1) 乙酸乙酯萃取物的分离：经1.2.2小鼠缩尿试验确定，对具有缩尿功效的乙酸乙酯萃取物(A)进一步分离。取适量乙酸乙酯萃取物，上样到MCI 柱(D 5 cm ×100 cm)，依次用体积分数为 50%，70%，80%，95%的乙醇进行梯度洗脱，薄层色谱法(TLC)跟踪检测洗脱液中的成分，分别得到P1(50%洗脱)、P2(70%洗脱)、P3(80%洗脱)、P4(95%洗脱)4个部分，分别减压浓缩后于-20 ℃冷冻保存备用。

(2) P1、P2、P3和P4的缩尿功效：按1.2.2益智仁小鼠缩尿试验方法，确定乙酸乙酯萃取物经MCI柱分离得到的P1、P2、P3和P4 4个组分的缩尿功效。其中，试验组小鼠均按1 g/(kg·d)剂量给药，灌胃体积为0.1 mL/10 g。

(3) 单体化合物的的分离及鉴定：将具有缩尿功效的P3、P4样品分别反复通过ODS-D(D 3 cm ×100 cm)、ODS-AQ(D 3 cm×100 cm)色谱柱进行分离，自动收集器收集洗脱液(15 mL/管)，TLC法跟踪检测洗脱液成分，将显色反应和Rf值一致的洗脱液合并，最终得到4个单体化合物。用CDCl3为溶剂，经1H NMR和13C NMR等光谱数据分析，确定其纯度和结构。

(4) 单体化合物Ⅰ、Ⅱ的缩尿功效：按1.2.2益智仁小鼠缩尿试验方法，确定单体化合物Ⅰ、Ⅱ2个单体化合物的缩尿功效。试验组小鼠均按1 g/(kg·d)剂量给药，灌胃体积为0.1 mL/10 g。

2 结果与分析

2.1 益智仁提取物缩尿功效

益智仁提取物对小鼠尿量的影响见表1。

由表1可知，前2，6 h尿量/体重，只有A组小鼠较空白对照组相比显著下降(P<0.01)，说明A样品中存在具有缩尿功效的成分。而且前2 h显著减少也说明了A样品能在短期内快速对尿量的产生起到抑制作用。其他4组小鼠的尿重/体重在前2，6 h内较空白对照组均无明显改善，故表明不含缩尿活性成分。

2.2 乙酸乙酯萃取物不同组分缩尿功效

乙酸乙酯萃取物不同组分对小鼠尿量的影响见表2。

由表2可知，前2 h内，P3组小鼠较空白对照组尿量/体重显著下降(P<0.05)，P4组小鼠较空白对照组尿量/体重下降趋势比P3更为显著(P<0.01)。6 h总尿量和体重比结果表明，P4组较空白组仍有显著下降差异(P<0.01)，得出P3、P4组均含有具有缩尿功效的成分，并能在短期内快速对尿量的产生起到抑制作用。P1、P2组小鼠的尿重/体重在前2，6 h内与空白组相比均无明显差异，说明该部分没有缩尿活性成分。

表1 益智仁提取物对小鼠尿量影响†

† 与空白对照组比较，** P<0.01。

表2 乙酸乙酯萃取物不同组分对小鼠尿量的影响†

† 与空白对照组比较，* P<0.05；** P<0.01。

通过ODS-D(D 3cm ×100 cm)、ODS-AQ(D 3 cm×100 cm)色谱柱分离， TLC法跟踪检测，最终，从P3样品中分离得到化合物Ⅰ，从P4样品分离得到化合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。

2.3 乙酸乙酯萃取物中化合物的鉴定

化合物Ⅰ、Ⅱ的13C核磁共振数据见表3、4，化合物Ⅰ、Ⅱ的结构式见图1。

化合物Ⅰ为黄色油状物，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。

从1HNMR(CDCl3，500 MHz)可见：δ6.69(2H，m)和δ6.57(1H，J=10.5)为一组1,3,4-三取代苯环上的质子信号，δ7.20～7.06(5H，m)为一组单取代苯环上得到质子信号；δ3.74(3H，s)为甲氧基质子信号，δ1.45～2.72，为6个—CH2— 氢信号。

从13C-NMR可见：该化合物共有19个碳信号，低场区出现9个碳信号，其中有6个为1,3,4-三取代苯环上的碳信号，化学位移分别为δ134.2，113.3，148.9，145.9，116.3，121.9，其他3个为单取代苯环上的碳信号，化学位移分别为δ143.6，129.6，126.9，δ56.5为1个甲氧基碳信号，结合135DEPT 得知δ45.5，43.7，36.8，32.2，30.7，24.5为6个亚甲基上的碳信号。

从135DEPT可见：该化合物有1个双键信号，δ56.6为1个—OCH3碳信号，δ24.5～45.5为6个—CH2—碳信号。结合以上光谱分析，得出化合物1为3-甲氧基-4羟基-二苯己烷，该化合物为益智仁中首次发现。

化合物Ⅱ为黄色颗粒状，易溶于氯仿、乙酸乙酯，可溶于甲醇、乙醇。

从1HNMR(CDCl3，500 MHz)可见：δ：5.36(1H，s)，δ：3.53(1H，s)，δ：1.18(1H，s)，δ：1.25(1H，s)，δ：1.45(1H，s)，δ：1.56(1H，s)，δ：1.65(1H，s)，δ：1.84(1H，s)，δ：1.95(1H，s)，该化合物含有1个连氧氢，出现在较低场区的信号δ2.29～1.06是环状烷烃上的—CH2—氢信号。

从13C-NMR可见：该化合物共有32个碳信号，其中δ140.8和δ121.6为二个烯碳信号，表明化合物含有1个双键，δ71.7为1个连氧碳信号，δ11～56为29个碳信号。

从135DEPT可见：该化合物有1个双键信号，δ11.8～19.8 为7个—CH3碳信号，δ21.1～42.2为15个—CH2—碳信号，δ28.2～50.2为6个—CH—碳信号。

从以上信息可得，该化合物为甾醇类化合物，与相关文献[12]比较，母环部分与β-谷甾醇数据基本一致，不同的是该化合物含有32个碳信号，则多余的3个碳信号形成一个丙基，从母环上可以看出C-20本应该是1个—CH—信号，但在NMR数据中未见该信号，而在δ31.9处出现1个季碳信号，因此判断丙基应连接在C-20位上。最终得出该化合物为20-丙基-β-谷甾醇，并且该化合物在益智仁中首次分离得到。

化合物Ⅲ为亚油酸，化合物Ⅳ为油酸。

表3 化合物Ⅰ的13C核磁共振数据

表4 化合物Ⅱ的13C核磁共振数据

图1 化合物Ⅰ和Ⅱ的化学结构

2.4 单体化合物的缩尿功效

化合物Ⅰ、Ⅱ对小鼠尿量的影响见表5。

由表5可知，前2 h内，Ⅰ、Ⅱ组小鼠较空白对照组尿量/体重下降极显著(P<0.01)。对6 h总尿量和体重比进行测定，Ⅰ组小鼠较空白对照组尿量/体重下降显著(P<0.05)，但Ⅱ组较Ⅰ组下降趋势更为显著(P<0.01)，得出化合物Ⅰ和化合物Ⅱ均具有缩尿的功效，且化合物Ⅱ效果更明显。同时二者能在短期内快速对尿量的产生起到抑制作用。

表5 不同单体化合物对小鼠尿量的影响†

† 与空白对照组比较，* P<0.05；** P<0.01。

3 结论

益智仁乙醇提取物乙酸乙酯萃取相经MCI柱分离，80%和95%乙醇洗脱物对小鼠缩尿有显著作用，从这2个洗脱物中分离得到4种单体化合物，分别为3-甲氧基-4羟基-二苯己烷、20-丙基-β-谷甾醇、油酸和亚油酸，前2个化合物均为首次报道。根据相关文献可知油酸、亚油酸不具有缩尿的功效，因而可以得出3-甲氧基-4羟基-二苯己烷和20-丙基-β-谷甾醇为益智仁中具有缩尿作用的主要功效成分，这与文献[13]报道益智仁中具有缩尿作用的化合物为二苯庚烷类化合物的结果不一致。同时结果表明，20-丙基-β-谷甾醇的缩尿效果较优于3-甲氧基-4-羟基-二苯己烷。通过研究，本试验确定了益智仁中具有缩尿作用的2种单体化合物，经文献调研，分析二者可能是通过某种途径调节了膀胱逼尿肌的收缩和舒张，增加了膀胱的容量，从而达到减少尿量的作用，因此二者在体内通过何种途径发挥缩尿作用及其作用靶点有待进一步研究。