靖州杨梅果酒发酵菌种筛选、鉴定及发酵性能研究

阳秀莲刘 伟林树花陈万能张菊华,3

(1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所， 湖南 长沙 410125；3. 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125； 4. 湖南省靖州县湘百仕酒业有限责任公司，湖南 怀化 418400)

杨梅(MyricarubraSieb. & Zucc.)为杨梅属杨梅科乔木或灌木常绿植物。中国杨梅产量占世界总产量的98%以上[1]，浙江、湖南等省份均有分布。目前湖南杨梅栽培面积约1.0×104hm2，其中，靖州县栽培面积达到6 667 hm2，年产杨梅6.0×104t，已成为中西部地区最大的产区。杨梅酸甜可口营养丰富，不仅能生津止渴、消食解暑[2]，还具有抗氧化[3]、降血糖[4]、抑癌[5]等功效。由于果实裸露，易受到机械损伤和微生物侵染，不耐贮运且上市集中，极大地制约了杨梅产业发展。杨梅酒加工有助于减少采后损失、改善杨梅营养价值及延长货架期，提高水果产业附加值[6]。

发酵型杨梅酒是以杨梅汁为原料，加入优质的酿酒酵母发酵而成，口感柔和，营养丰富，具有杨梅果的典型性。发酵型果酒品质取决于所选择的酵母性能，酵母菌株的起酵、产酒、产香、耐性等特性不同，其作用也相差甚远。选育发酵性能优良、适合特定水果发酵的专用酵母已成为果酒酿造的研究热点[7]。酿酒酵母分离筛选主要是在酵母菌活跃存在的地方，如成熟水果、鲜榨果汁、果园土壤、空气和发酵醪[8]。目前，已从草莓[9]、人参果[10]、猕猴桃[11]等水果中筛选出发酵专用酵母，并开展了发酵性能和工艺优化等的研究。但目前市场上几乎没有杨梅果酒专用酵母，分离筛选适宜酿造杨梅酒菌种的研究也鲜有报道。仅杜晶等[12]从杨梅果园周边环境及自然发酵醪中筛选鉴定4株酵母(1株酿酒酵母和3株非酿酒酵母属酵母)，其发酵性能还有待研究。

本研究为挖掘靖州杨梅主产区的酵母资源，拟从土壤及果品表面开展酵母菌株的筛选，筛选出起酵速率快、酒精转化率高、酒精耐受力高、抗SO2能力强和风味独特的优质杨梅酿酒酵母，并进行菌株鉴定，确定菌株的最佳生长条件，以期为工业化生产提供优良发酵剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

从靖州县多个杨梅园采集鲜果、杨梅叶和土壤。

1.1.2 培养基

麦芽汁培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD培养基)、酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD液体培养基)：自然pH值，115 ℃高压灭菌15 min，广东环凯微生物科技有限公司；

2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC)上层培养基：添加0.05% TTC试剂至灭菌冷却约50 ℃的YPD培养基中混合均匀；

TTC下层培养基：YPD培养基。

1.1.3 主要试剂与仪器

蔗糖：食品级，大润发超市；

TTC：分析纯，上海灵锦精细化工有限公司；

其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

智能恒温恒湿培养箱：HWS型，宁波江南仪器厂；

全自动色度分析仪：Color Quest XE型，美国HunterLab公司；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，岛津仪器(苏州)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离

(1) 样品处理：分别称取土壤、杨梅果、树叶各10 g于90 mL YPD液体培养基中，振荡培养24 h，取上清液梯度稀释，涂布于YPD培养基上，倒置培养2～3 d[13]。杨梅果实破碎去核榨汁，装入无菌三角瓶中发酵，不定期振摇，发酵第1，3，5，7天取样，梯度稀释涂布于YPD培养基上，培养2～3 d。培养温度均为28 ℃。

(2) 分离纯化：挑选具有典型酵母特征的菌落进行平板划线，纯化后接种至YPD斜面培养12～24 h，置于4 ℃冰箱保存[14]。

1.2.2 酵母筛选

(1) 一级筛选(TTC显色法)：参考文献[15]。

(2) 二级筛选(杜氏管法)：参考文献[12]修改如下，菌种添加量为5%(菌液浓度为107CFU/mL)，杨梅汁的SSC为7%，pH为3.0，85 ℃水浴加热15 min后迅速冷却。

(3) 三级筛选(糖发酵试验)：参考文献[16]修改如下， 5 mL 的豆芽汁中分别加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，不加糖的豆芽汁为对照组。

(4) 四级筛选(杨梅酒发酵法)：活化酵母菌液，接种量为5%，SO2添加量为50 mg/L、加糖量为170 g/L，杨梅汁pH为2.7，主发酵温度 24 ℃，主发酵停止后测定总糖、总酸、总花色苷、色差值并进行感官评价。

1.2.3 形态学观察 将斜面保藏的酵母在YPD平板上划线，28 ℃培养3～4 d后观察菌落形态，并制成菌悬液，在10×100倍显微镜下观察菌株的形态及出芽方式等。

1.2.4 分子生物学鉴定 采用上海生工Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取菌株DNA，对26S rDNA中的D1/D2区域基因进行序列扩增，PCR产物用1%的琼脂糖电泳进行检测，经纯化后送至生工生物工程(上海)公司测序，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST程序中比对，用MEGA 4.0绘制系统发育树，确定菌株的种属。

1.2.5 酵母发酵性能

(1) 生长曲线的测定：参考文献[17]修改如下，将菌液以1%的接种量分别接种至18瓶麦芽汁培养基中，设置1瓶未接种的发芽汁为空白对照，28 ℃振荡培养，前期每2 h取样，后期每4 h或6 h间隔取样，据实际情况稀释，测定麦芽汁培养基的OD值(600 nm)，重复3次，绘制生长曲线。

(2) 酵母耐糖、SO2、pH、酒精性能研究：将菌株活化后接种至YPD液体培养基中，28 ℃培养12 h，接种量为3%，分别添加菌液至含SSC(16%，20%，24%，28%，32%)的YPD液体培养基、含SO2(40，80，120，160，200 mg/L)的YPD液体培养基、含酒精(8%，10%，12%，14%，16% Vol)的YPD液体培养基和不同pH值(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0)的YPD液体培养基中。28 ℃振荡培养48 h，取样稀释10倍，测量其OD值(600 nm)，重复3次。

1.2.6 检测方法

(1) 总糖：采用直接滴定法[18]5。

(2) 总酸：采用电位滴定法[18]7。

(3) 酒精度：采用酒精计法[18]4。

(4) 色差值：采用色差仪测定。

(5) TSS：采用手持糖度仪测定。

(6) pH值：采用pH计测定。

(7) 总花色苷：采用pH示差法[19]。

2 结果与分析

2.1 酵母的分离

从靖州县不同杨梅园中采集样本共67份，经梯度稀释涂布、分离纯化和菌落形态观察后共得到172株菌，其中土壤43株，杨梅叶32株，鲜果59株，发酵汁38株。

2.2 酵母的筛选

2.2.1 一级筛选 利用TTC显色原理对酵母菌株的活性和产酒精能力进行筛选。菌落颜色越深，表明其活性越高，产酒精能力越强；呈浅红色或无色，表明其活性较低，产酒精能力较弱或不产酒精[20]。TTC显色反应后的菌株呈色情况如图1所示，共有65株呈深红色，49株呈玫红色，37株呈淡粉色，21株基本无颜色变化。TTC显色法中选取菌落颜色呈深红色的65株菌株进行下一步筛选。

图1 TTC平板显色筛选

2.2.2 二级筛选 酵母发酵过程中产生CO2气体，杜氏管中气泡的体积和数量可直接反映菌株发酵的起酵速度和发酵能力[21]。通过杜氏管筛选试验，筛选出能在低pH的杨梅汁中发酵产气，且在48 h内充满杜氏管的菌株[22]。如表1所示，19株在48 h内充满杜氏管，36株规定时间内未充满杜氏管或没有明显产气现象。选取充满杜氏管的19株进行下一步筛选。

表1 杜氏管产气情况†

† “+”表示杜氏管已充满；“-”表示杜氏管未充满。

2.2.3 三级筛选 碳源的利用能力是考察菌株性能的一个重要指标，在糖发酵试验中，菌株对各类糖的利用程度不一[23]。如表2所示，72 h内充满杜氏管的菌株，蔗糖组有9株，葡萄糖组有9株，果糖组有11株，麦芽糖组和对照组无充满现象。结果表明，果糖最易被菌株利用，起酵速度快且产气速率高，蔗糖和葡萄糖次之。但考虑工厂实际成本，添加蔗糖(白砂糖)作为菌株能量来源最为经济，故选取能有效利用蔗糖的9株菌株进行下一步试验。

表2 不同糖发酵72 h杜氏管产气结果†

† “-”表示杜氏管中没有气泡产生；“+”表示杜氏管中有气泡产生但未被充满；“√”表示杜氏管已被充满。

2.2.4 四级筛选 通过比较9株菌发酵果酒的各项指标，筛选出发酵能力强、香气浓郁、色泽鲜亮的菌株。

由图2可知， DY5与JW14发酵果酒在色泽和香气特征方面最为突出，综合感官评分高，具有浓郁和谐的果香和酵母香，但酒味不突出；RY1具有较好的酒香味，其果香不明显，滋味和风格最好，综合评分较高；其他6株发酵果酒整体评分偏低，风格和滋味特征不显著。结果表明，JW14与DY5色泽显著；DY5香气显著；RY1在风格与滋味上显著，此3株菌株的综合感官评分高于其他菌株。

图2 果酒感官评分雷达图

通过色差L*、a*、b*值(图3)结合总花色苷(表3)含量可知，杨梅汁的颜色最深，L*值最小，总花色苷含量最高，为187.491 mg/L。在发酵过程中，发酵温度、SO2添加量、pH、酵母菌株等因素会引起果酒色泽和花色苷含量的变化[24]。在9株酵母发酵果酒中，颜色最深的为DY5和JW14，其色差值相差较小，但DY5总花色苷含量最高；RY1颜色稍浅，可能是该菌株活性高对花色苷的降解作用大而导致；其他果酒花色苷含量低，色泽较差。

图3 发酵杨梅酒的色差值比较

表3 菌株发酵杨梅酒的理化指标†

† “-”表示该指标未检测。

杨梅酒理化指标如表3所示，RY1酒精度最高，DY5和JW14次之，其他杨梅酒的酒精度皆低于6% Vol；总糖含量RY1最低，DY5和JW14较低，其他杨梅酒的总糖含量比RY1高2.7～3.4倍。在初始糖含量相等的情况下，总糖含量越低，酒精度越高，则菌株的发酵能力越强。由于杨梅汁的总酸含量较高，采用小容器发酵且未进行降酸处理，导致9株菌发酵的杨梅酒口感偏酸[25]。

综上，RY1菌株的产酒精能力强，感官评分高，酵母活性好，适合普通的杨梅果酒酿造。DY5菌株和JW14菌株产酒精能力较强，果酒中果香浓郁，总花色苷含量高，酒体颜色艳丽，感官评分高，适合酿造低度数果酒饮料或协助增香。此3株酵母具有较好的应用前景，故选取RY1、DY5、JW14 3株菌株进行形态学、分子生物学鉴定。

2.3 形态学鉴定

DY5、RY1、JW14 3株菌株的形态见图4。

(1) DY5菌株：菌落呈圆形，菌株平整，乳白色，中心处颜色较深，边缘整齐，菌落光滑湿润易挑起，有浓郁的酵母香；细胞形态为纺锤状，出芽生殖。

(2) RY1菌株：菌落呈圆形，中心点凸起，色泽呈乳白色，颜色均匀，边缘整齐，菌落光滑湿润易挑起，有轻微的酒香；细胞形态为球形，出芽生殖。

(3) JW14菌株：菌落呈圆形，中心点微凸起，乳白色，边缘处颜色微浅，颜色似同心圆状，表面光滑不黏稠，不易挑起，有较浓郁的酵母香；细胞形态为纺锤状，出芽生殖。

2.4 分子生物学鉴定

以NL1和NL4为引物，对筛选得到的酵母菌进行了26S rDNA D1/D2区域序列扩增,得到的电泳图如图5所示。

图4 酵母菌形态特征图

将所得碱基序列在NCBI上比对，RY1的序列长度为588 bp，确定该酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；DY5的序列长度为586 bp，确定该酵母为仙人掌有孢汉逊酵母(Hanseniasporaopuntiae)；JW14的序列长度585 bp，确定该酵母为有孢汉逊酵母属(Hanseniasporapseudoquilliermondii)，各株菌系统发育树如图6～8所示。

2.5 酵母发酵性能

2.5.1 生长曲线测定 如图9所示，菌株RY1与菌株DY5活性较高，前2 h为延滞期，之后迅速进入对数期，RY1对数期时长为16 h，在18 h后进入稳定期，其进入对数期早，时间长；DY5菌株对数期时长为14 h；JW14菌株的延滞期稍长，呈指数增长速度较慢，在16 h以后趋于平稳。3株菌株在48 h内没有明显的衰亡期，与前人[26-27]研究结果一致。

1. JW14菌株 2. DY5菌株 3. RY1菌株 M. Mark

2.5.2 高糖耐受性 在杨梅果酒发酵过程中需添加蔗糖，为酵母的生长代谢提供充足的能量。糖原添加量过高会降低酵母活性，抑制其生长。耐受较高浓度糖溶液的菌株，其产酒精能力强，可降低发酵产物对菌株本身的毒害和抑制作用[28]。由图10可知，3株酵母菌在SSC为16%时，OD值最大，表明该糖浓度下菌株生长旺盛；随着SSC增加，OD值均有所减小；在SSC为32%时，RY1菌株与DY5菌株的OD值略有下降，JW14菌株的曲线变化较大，OD值最小。结果表明，含糖量越高，酵母在高渗透压的环境下其生长活性受到了一定的抑制，其中RY1具有在高糖溶液下发酵的潜力，DY5菌株和JW14菌株适合在正常糖含量的环境下发酵。

图6 菌株RY1系统发育树

图7 菌株DY5系统发育树

图8 菌株JW14系统发育树

图9 菌株生长曲线的测定

图10 菌株高糖耐受性

2.5.3 SO2耐受性 在果酒发酵过程中，SO2添加量过低，发酵液易受到杂菌的污染；SO2添加量过高，酵母的生长繁殖受到抑制，发酵进程缓慢[29]。由图11可知，3株菌株的OD值随SO2添加量增加而有所减小，在SO2添加量为200 mg/L 时，仍保持较高的活性，OD值相差较小。加入高浓度的SO2，菌株前期受到抑制，在震荡培养过程中SO2加速挥发，其抑制能力减弱，菌株正常生长，在48 h后测其OD值，数值变化不大。结果表明3株酵母均能耐受200 mg/L的SO2添加量。

图11 菌株SO2耐受性

2.5.4 低pH耐受性 耐酸性是考察酵母性能的一个重要指标，杨梅果汁中的pH值普遍较低，为3.0左右，菌株的低pH耐受性强，可降低发酵液被污染的风险。由图12 可知，RY1菌株最适生长pH值为3.0，DY5菌株和JW14菌株的最适生长pH为3.5。3株菌株都能耐受pH 2.0的环境，在pH 2.5及以上能较好地生长，在pH 3.0 左右生长旺盛，此pH与杨梅汁相近，因此均适合杨梅酒发酵。

图12 菌株pH耐受性

2.5.5 酒精耐受性 酵母菌在产酒精的同时，自身会受到胁迫作用，酵母细胞的生长会因酒精的毒害作用而受到抑制，从而影响发酵液中酒精的形成[30]。菌株对酒精的耐受性分为3个等级：只能耐受酒精含量为6% Vol以下的菌株，乙醇耐受性差；能耐受6%～10% Vol，菌株耐受性一般；能耐受11% Vol及以上的对酒精具有高耐受性[31]。由图13可知，菌株RY1、DY5与JW14随着酒精体积分数增大，OD值稍有下降，在酒精含量为16% Vol时，OD值下降不明显，菌株仍保持较好的活性，说明3株菌株均能耐受高酒精含量的溶液，能满足杨梅酒的酿造需求[32]。

图13 菌株酒精耐受性

综上所述，通过测定RY1、DY5、JW14菌株在高糖、低pH、高SO2添加量及高酒精体积分数环境下的耐受性，发现酿酒酵母RY1的活力最高，耐受性最强，能在SSC 36%、pH 2.0、SO2添加量200 mg/L、酒精含量16% Vol 的环境下保持较好的生长活性；JW14酵母活性较低，其耐受性相对较差，勉强能耐受32%的高糖溶液和pH 2.0 的低酸溶液；DY5酵母活性及耐受性介于菌株RY1和JW14之间，3株酵母的性能符合果酒酿造要求，适用于发酵杨梅酒。

3 结论

本研究筛选出3株综合性能优良的菌株，经分子生物学鉴定：菌株RY1为酿酒酵母属(Saccharomycescerevisiae)，菌株DY5为仙人掌有孢汉逊酵母属(Hanseniasporaopuntiae)，菌株JW14为有孢汉逊酵母属(Hanseniasporapseudoquilliermondii)。通过耐受性试验，发现RY1酵母活性高，产酒精能力及耐受性强，香气协调，适合发酵杨梅果酒；DY5和JW14酵母酒精发酵能力一般，具有较好的产香能力，适宜发酵低度数杨梅饮料和辅助发酵增香。

但有关湖南地区酵母菌的生理生化、发酵特性及其进一步利用仍需继续研究。