HS-SPME-GC-MS结合自动解卷积技术分析阿胶中的挥发性成分

张鹏云李 蓉龙春霞林淑绵张 峰

(1. 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东 中山 528400；2. 广东药科大学公共卫生学院， 广东 中山 528458；3. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100176)

阿胶(CollaCoriiAsini) 是一种名贵的中药材，又名驴皮胶、盆覆胶，由马科动物驴 (EquusasinusL.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩而制成[1]。阿胶被称为补血圣药，药食两用，在临床上可用于治疗妊娠胎漏、劳嗽咯血、肺燥咳嗽，便血崩漏等疾病[2]。药理研究表明，阿胶具有增加白细胞[3]、补血造血[4]、抗衰老[5]等作用。而阿胶在提取过程中驴皮中的胶原蛋白不断水解，水解程度不同，提取物的粗糙感、杂质含量、储存时间、碱性挥发性物质的挥发程度也不同，就会产生不同质量的阿胶产品[6]。此外阿胶带有浓重的腥气，气味并不能被大多数人接受，但是根据其腥气的化学组成进行针对性调控，可以改善阿胶的风味[7]。因此，研究阿胶的挥发性成分不但有助于理解阿胶的药物作用机制，还可以用来判断其质量，改善其风味，对阿胶产品的研发与发展有重要的指导意义。

近年来，中国已有学者对阿胶香气成分有所研究，如毛跟年等[8]对阿胶腥味物质进行了分析，鉴定出23种物质；王进等[9]分析了 3个品牌阿胶挥发性成分，共鉴定出49种成分，并利用气相色谱—嗅闻技术鉴定出14种活性香气成分；佘远斌等[10]比较了5个品牌阿胶香气成分的特征与差异，并鉴定出65种化合物，但上述挥发性成分是由蒸馏法或同时蒸馏萃取法制得，操作复杂并使用大量溶剂。虽然肖作兵等[11]曾利用顶空—固相微萃取法提取了9种阿胶挥发性物质，但是未分析不同因素对阿胶挥发性成分萃取效果的影响，且在定性过程中只运用了谱库对照。而阿胶挥发性成分复杂，色谱分离能力又有限，一些极性相似的组分色谱峰会重叠，仅根据谱库检索来确认化合物，会使定性结果不准确[12]。

本研究拟采用顶空—固相微萃取法(head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME)提取阿胶挥发性成分，利用单因素和正交试验研究样品量、萃取温度、萃取时间、平衡时间、解吸时间对萃取效果的影响，并确定HS-SPME-GC-MS分析阿胶挥发性物质的较优条件。再利用自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)对挥发性成分总离子流图进行解卷积处理，提取未知组分更“纯净”的质谱图，之后通过谱库检索匹配，结合保留指数(Retention index，RI)来定性[13-14]，使定性结果的准确度进一步提高。旨在为阿胶挥发性成分的提取与鉴定提供参考方法，为阿胶的鉴别与品质评价提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东阿阿胶块(批号：1605003)：山东东阿阿胶，常温储存；

正构烷烃混合标准品(C7～C40)：美国O2si公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱—三重四级杆串联质联仪(GC-MS/MS)： TSQ 8000型，配电子电离源及Xcalibur数据处理系统、TRIPLUS RSH自动进样器，美国Thermo Fisher公司；

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；

2014 NIST 2.2标准质谱库：美国国家标准与技术研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 顶空固相微萃取法 先将阿胶块粉碎，然后准确称取一定量阿胶粉末置于20 mL顶空瓶中(配有聚四氟乙烯垫的螺纹密封盖)，自动进样器将顶空瓶放在具有一定温度的孵化炉中平衡数分钟后，将已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头迅速插入样品瓶顶空部分进行热吸附，然后将萃取头插入气相色谱进样口，在250 ℃条件下进行解吸，最后进入GC-MS/MS系统进行分离检测。

1.3.2 萃取条件的优化 在预试验基础上，选取挥发性物质的总峰面积和峰数目为考察指标，研究不同因素对阿胶挥发性物质萃取效果的影响。

(1) 样品量：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在萃取温度50 ℃，萃取时间30 min，平衡时间10 min，解吸时间5 min的条件下，考察不同样品量(2，3，4，5，6 g)的萃取效果，每个水平重复3次。

(2) 萃取温度：在样品量优化结果基础上，考察不同萃取温度(50，60，70，80，90 ℃)的萃取效果，每个水平重复3次。

(3) 萃取时间：在样品量和萃取温度优化结果的基础上，考察不同萃取时间(30，40，50，60 min)的萃取效果，每个水平重复3次。

(4) 平衡时间：在样品量，萃取温度和萃取时间优化结果的基础上，考察不同平衡时间(5，10，15，20 min)的萃取效果，每个水平重复3次。

(5) 解吸时间：在以上因素的优化条件下，考察不同解吸时间(3，5，7，9 min)的萃取效果，每个水平重复3次。

1.3.3 GC-MS分析条件

(1) 色谱条件：TR-PESTICIDE弹性石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升温至180 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min的速率升温至250 ℃并保持3 min；柱流速1.2 mL/min，分流比10∶1；进样口温度250 ℃；载气为高纯度(99.999%)氦气。

(2) 质谱条件：EI离子源；离子源温度280 ℃；传输线温度280 ℃；电子轰击能量70 eV；全扫描；质量扫描范围m/z35～450，溶剂延迟3 min。

1.3.4 定性分析 应用自动质谱退卷积定性系统AMDIS对阿胶挥发性物质总离子流图(TIC)自动进行反卷积处理，所分辨的质谱在2014版NIST2.2标准谱库中检索，根据匹配度和保留指数进行核对，只选择正匹配和反匹配均>800的物质，并用峰面积归一化法计算阿胶各挥发性物质的相对含量。

保留指数是C7～C40正构烷烃混标在和阿胶样品相同的分析条件下进样后，自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)根据正构烷烃的保留时间，自动计算出各挥发性组分的保留指数。

2 结果与讨论

2.1 HS-SPME条件的选择

2.1.1 样品量对萃取效果的影响 由图1可知，随着阿胶样品量的增加，挥发性成分的总峰面积和峰数不断增大。当样品量超过5 g时，挥发性成分的总峰面积和总峰数变化趋势不明显，这是因为此时吸附和解吸附已达到平衡，挥发性成分处于饱和状态，即使再多的样品，挥发性成分的总量还是一定的。因此选择5 g为较佳样品量，不但保证了萃取效果，还节约了样品。

图1 样品量对阿胶挥发性成分萃取效果的影响

Figure 1 Effect of sample amount on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.2 萃取温度对萃取效果的影响 由图2可以看出，当萃取温度不断升高时，阿胶挥发性物质的总峰面积呈先上升后下降的趋势，在70 ℃时达到最大值，而峰数目也呈先上升后降低的趋势，但在80 ℃时达到最大值。这是因为温度升高加快了挥发性组分的扩散速率，促进了萃取头对目标物的富集吸附[15]。但萃取是一个放热过程，高温会降低挥发性物质在萃取头和样品之间的分配系数，导致萃取头对挥发性物质的吸附量降低，另外高温还可能使部分挥发性化合物发生变性或裂解，影响萃取结果的准确性[16]。因此造成80 ℃时，挥发性物质的峰数目较多而总峰面积却下降的结果。综合考虑，选择萃取温度为70 ℃。

2.1.3 萃取时间对萃取效果的影响 由图3可以看出，随着萃取时间的延长，阿胶挥发性成分的峰数目基本保持不变，而总峰面积不断增加。当萃取时间为30～50 min 时，总峰面积上升趋势显著；当萃取时间超过50 min 时，总峰面积变化不明显，说明50 min时挥发性物质已达到较平衡状态。这可能是萃取时间过短时，挥发性化合物吸附不充分；萃取时间过长时，已经被萃取头吸附的组分可能脱附，降低了萃取效果[17]。综合考虑，选择萃取时间为50 min。

图2 萃取温度对阿胶挥发性成分萃取效果的影响

Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

图3 萃取时间对阿胶挥发性成分萃取效果的影响

Figure 3 Effect of extraction time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.4 平衡时间对萃取效果的影响 由图4可以看出，随着平衡时间的延长，阿胶挥发性成分的总峰面积先增大后减小，在10 min时达到了最大值，而峰数目变化不明显，在10 min 时略有增加而后基本保持不变。由此可以说明，当平衡时间为10 min时，挥发性物质在样品和顶空部分已达到了较平衡的状态，有利于萃取头稳定吸附。所以将平衡时间设定为10 min。

图4 平衡时间对阿胶挥发性成分萃取效果的影响

Figure 4 Effect of equilibrium time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.1.5 解吸时间对萃取效果的影响 图5显示，随着解吸时间的延长，阿胶挥发性成分的总峰面积和峰数目均呈先增加后减小的趋势，且都在5 min时达到最大值。说明此时，挥发性组分已解吸完全，再延长时间反而会降低萃取效率。在同一解吸温度下，解吸时间决定着挥发性化合物能否完全进入气相色谱柱。若解吸时间不够，挥发性组分解吸不完全，萃取头上有残留，不但影响方法的灵敏度，还会使后续样品分析受到污染；反之，当解吸时间过长时，会导致峰形变宽，高温下部分组分发生氧化，并且影响萃取头的使用寿命[18]。因此，选择解吸时间为5 min。

图5 解吸时间对阿胶挥发性成分萃取效果的影响

Figure 5 Effect of desorption time on the extraction of volatile compounds fromCollaCoriiAsini

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，确定平衡时间为10 min，解吸时间为5 min，选择萃取时间、萃取温度和样品量作为3个影响因素，进行三因素三水平正交试验，正交试验设计如表1所示。

表2为正交试验结果，当以总峰面积作为萃取效果的考察指标时，由极差大小可知，3个因素对萃取效果的影响程度为B>A>C，即萃取温度影响最大，萃取时间和样品量影响次之，较优组合是A2B2C2。当以峰数目为指标时，从极差结果来看，较优组合同样是A2B2C2，因素作用主次为B>C>A，即萃取温度影响最大，样品量次之。由此可以看出，当考察指标不同时，因素影响作用略有差异。

表1 正交试验因素与水平

由于正交表中没有A2B2C2组合结果，所以需进行A2B2C2的验证实验，得出总峰面积为2 314 554 005，总峰数为58，该组合结果优于正交表中的任何一个。因此，最终确定顶空—固相微萃取法萃取阿胶挥发性成分的较优组合为A2B2C2，即：样品量5 g、萃取温度为70 ℃、萃取时间50 min、平衡时间10 min、解吸时间5 min。

2.3 重复性试验

采用上述优化的萃取条件，考察HS-SPME-GC-MS方法在分析阿胶样品挥发性成分时的重复性，试验重复6次。经计算，阿胶挥发性组分的峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.54%～10.40%，平均值为6.25%，说明该方法具有较好的重复性。

2.4 优化条件下阿胶挥发性成分的检测分析

在选定的HS-SPME优化条件下，对阿胶挥发性物质进行萃取，并通过GC-MS检测分析，得到阿胶挥发性成分总离子流图(图6)，除去因萃取头过热和柱流失产生的少量硅氧烷类杂质峰后，得到阿胶挥发性成分及相对百分含量，见表3。在较优条件下阿胶共分离得到54种挥发性成分，并鉴定出其中41种成分，占挥发性成分总量的95.83%，主要包括10种吡嗪类化合物(48.95%)、8种醛类化合物(26.37%)、5种酯类化合物(8.18%)、6种酮类化合物(6.43%)及13种其他类化合物(5.90%)。其中含量最高的成分为2,5-二甲基吡嗪，占挥发性物质总面积的20.35%，其次为壬醛(16.67%)、2,3,5-三甲基吡嗪(13.80%)、3-乙基-2,5-甲基吡嗪 (9.54%)、邻苯二甲酸二异丁酯(4.42%)、己醛(3.30%)、2-癸酮(3.23%)、苯甲醛(3.00%)、2-壬酮(1.95%)、2,2,4-三甲基戊二醇异丁酯(1.87%)，这10种成分共占阿胶挥发性物质总含量的78.14%。

表2 正交试验结果与分析

表3 阿胶的挥发性成分†

† 参考值通过http://webbook. nist. gov /chemistry /搜索获得。

图6 阿胶挥发性物质的总离子流图

吡嗪类化合物具有烤香、坚果香、咖啡香等香味特征，是氨基酸和还原糖发生Maillard反应形成的挥发性物质，在食品风味研究中具有重要价值[10]。由于阿胶的制作过程需要长时间加热，所以产生了大量的吡嗪类化合物，本研究鉴定出了10种该类化合物。据报道[19]，吡嗪类化合物具有改善血循环、预防心血管疾病、调节脂质代谢、抗组织纤维化和抗氧化等药理作用。根据孙惜时等[20]的研究结果，进一步证实了本研究鉴定出的2-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪具有抗氧化活性。

经比较发现，本研究鉴定出的化合物种类与文献[9～10]更为相似，主要为醛类和吡嗪类，但是含量差异较大。本研究中含量较高的壬醛、2,3,5-三甲基吡嗪、己醛、苯甲醛等化合物在文献中的含量同样较高， 而2-戊基呋喃在文献中含量较高，但在本研究中含量相对较低，可能是由于阿胶的品牌、加工工艺不一致所致。

3 结论

本试验确定了提取阿胶挥发性物质的较优条件为：50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、5 g阿胶样品、萃取温度70 ℃、萃取时间50 min、平衡时间10 min以及解吸时间5 min。在较优条件下，鉴定出41种阿胶挥发性成分，主要为吡嗪类、醛类、酯类、酮类等化合物。本研究为阿胶的快速检测、质量鉴定、香味调控、产品研发提供参考，但是该研究未比较不同品牌阿胶挥发性成分的差异，因此在下一步研究中将利用本研究的方法建立阿胶挥发性成分指纹图谱，比较不同品牌之间的差异与共性，并与新鲜驴皮的挥发性成分进行对比，共同分析阿胶的质量，为阿胶挥发性成分的研究提供更加丰富的数据。