奶粉中羟基磷灰石成分的检测

朱丽娴林勤保钟怀宁王 亮潘静静,3

(1. 暨南大学包装工程研究所产品包装与物流广东普通高校重点实验室，广东 珠海 519070； 2. 广东检验检疫技术中心广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 51632； 3. 暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632)

受国际环保团体“地球之友”委托，美国亚利桑那州立大学的纳米技术团队[1]测试了7款在售的澳洲婴儿配方奶粉，其中3种含有纳米羟基磷灰石，2种含有针状羟基磷灰石纳米微粒。羟基磷灰石[HA，Ca5(PO4)3或者是Ca5(PO4)3(OH)]是一种常见的磷酸钙矿物质，可以作为食品中的发酵剂、牙膏中的磨光材料、蔬菜罐头中的抗氧剂和结构稳定剂等。有人[2]将碳酸钙、柠檬酸钙、羟基磷灰石等形式的含钙物质作为钙补充剂，而澳新食品标准法典不允许在婴儿奶粉中添加针状纳米羟基磷灰石，或其他形态的羟基磷灰石作为补钙剂[3]，因有研究[4]表明纳米羟基磷灰石会造成老鼠肝细胞和肾细胞的死亡。据欧盟消费者科学委员会[4]报告表明，针状羟基磷灰石具有潜在的毒性，应禁止用于化妆品、牙膏、漱口水等产品中，因为它的尺寸、形状和结晶度都是未知的，而美国亚利桑那州立大学的纳米技术团队[1]的测试结果发现被禁用于化妆品和日用品的物质存在于婴儿奶粉中，引起人们的担忧。

纳米技术的发展在不同领域得到了广泛应用，纳米工程材料作为食品添加剂是其主要用途之一，二氧化硅纳米材料和二氧化钛纳米材料是食品添加剂及日用品中常见的纳米材料，有学者[5-7]利用ICP-MS或Single-particle ICP-MS测定食品中二氧化硅和二氧化钛的含量，同时利用扫描电子显微镜、透射电子显微镜对其进行形态和纳米尺寸的表征，食品中纳米材料的检测具有一定的挑战，纳米材料的安全性评估需要更多的研究[8-10]。中国对羟基磷灰石的研究在于其制备及表征[11-12]，王宇明等[12]制备了纳米羟基磷灰石并利用X射线衍射等手段对其进行表征；对于奶粉中纳米羟基磷灰石的检测中国尚未进行研究，因针状纳米羟基磷灰石的安全性存在一定的争议，对奶粉中是否含有纳米羟基磷灰石的研究很有必要。

本研究拟选用市售5种奶粉(婴幼儿奶粉和成人奶粉)，通过分离提取奶粉中的无机成分富含物后，利用X射线粉末衍射仪对其中的无机成分富含物进行定性分析，以及用电子显微镜观察提取物的尺寸和形态；同时对空白奶粉样品进行加标试验，采取相同的分离提取方法后进行XRD测试和电子显微镜观察表征，以验证方法的可行性。旨在为奶粉中纳米成分的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5种奶粉样品：京东超市，分别标记为S1～S5，S1和S2为婴幼儿奶粉，S3～S5为成人奶粉；

纳米羟基磷灰石标准品：纯度为99%，针状，20 nm，北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超纯水器：EPED-10TS型，南京易普达科技发展有限公司；

超声波清洗机：LABUY-10LHT型，杭州莱博仪器设备有限公司；

真空冷冻干燥机： LABOGENE CS55-4型，丹麦Labogene 公司；

双光路粉末X射线衍射仪：D8 ANVANCE TWIN TWIN型，德国布鲁克AXS公司；

电子分析天平：FA1604N型，精度0.000 1 g，上海菁海仪器有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：Nicolet iS50型，美国热电公司；

高速冷冻离心机：TGL-16gR型，上海安亭科学仪器厂；

扫描电子显微镜：XL-30E型，荷兰Philips公司；

透射电子显微镜(连接能谱仪)：JEOL-2100F型，日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 羟基磷灰石的提取 分别称取S1～S5 5种奶粉样品各6 g(精确到0.01 g)于100 mL玻璃烧杯中，加入40 mL 超纯水后摇匀，将烧杯置于超声机中超声分散处理(功率80 W，30 min)，使得奶粉中有机成分和无机成分分散更均匀；将烧杯中样品转移至多个10 mL离心管中，进行离心处理(转速10 000 r/min，温度20 ℃，25 min)，用于除去奶粉中较轻的成分，合并收集多个离心管底部的成分，并用超纯水冲洗2～3次；将冲洗后的底部成分置于真空冷冻干燥机中进行干燥处理(温度-50 ℃以下，12 h)[1]。

1.3.2 粉末X射线衍射仪和傅里叶变换红外光谱仪分析

按照1.3.1的步骤提取奶粉样品中的羟基磷灰石，取适量的冷冻干燥后的样品研磨成粉末后进行X射线粉末衍射分析。粉末X射线衍射仪的工作电压和电流分别为40 kV和40 mA，测量的衍射角度范围2θ为10°～70°，每步扫描时间为5 s，得到的结果图与标准物质的衍射图比较[1]。

取少量1.3.1冷冻干燥后的样品与溴化钾混合研磨成粉末后压片进行傅里叶变换红外光谱仪分析，光谱范围为400～4 000 cm-1[13]。

1.3.3 电子显微镜分析 扫描电子显微镜样品处理，取少量1.3.1冷冻干燥后的样品和加标样品于粘有导电胶的铜台上，进行喷金处理增加样品的导电性，置于扫描电子显微镜中进行观察。

透射电子显微镜样品处理，取少量1.3.1冷冻干燥后的样品和加标样品于离心管中，加入适量的无水乙醇，振荡摇匀，并吸取少量滴到铜网上，待干燥后进行透射电镜观察，并对确定部位使用能谱仪进行元素成分分析。

1.3.4 加标试验 称取空白奶粉样品(S2)并加入针状纳米羟基磷灰石标准品(20 nm)共6 g于100 mL玻璃烧杯中，使得加入的羟基磷灰石标准品与空白奶粉样品的质量比分别为0.1%，0.3%，0.8%，经1.3.1步骤进行处理后，进行粉末X射线衍射仪分析、扫描电子显微镜和透射电子显微镜(连接能谱仪)观察。

1.4 数据处理

X射线粉末衍射图及红外光谱图的图像处理均采用美国OriginLab公司的Origin 9.0版本。

2 结果与分析

2.1 方法验证

图1为空白加标样品的X射线粉末衍射图，可以看出羟基磷灰石标准品在2θ衍射角度10°～70°时具有多个特征衍射峰，其中30°～35°时出现的3个衍射峰和25°～26°时出现的1个衍射峰相对于其他衍射峰高，这4个衍射峰对应的衍射角度是羟基磷灰石的特征峰角度(与国际衍射数据中心，ICDD数据库中羟基磷灰石标准物质的衍射图相同)。3种加标浓度0.1%，0.3%，0.8%(羟基磷灰石标品与空白奶粉样品的质量比)样品的X射线粉末衍射图与羟基磷灰石标准品的衍射图相近，均在25°～26°时1个角度和30°～35°时的3个角度出现了衍射特征峰，且加标空白样品中的其他衍射峰与羟基磷灰石的相对应(图中*标出的峰)，可以判定3种加标空白样品的X射线粉末衍射图即为羟基磷灰石的衍射图。加标试验结果表明，空白样品中添加不同浓度的纳米羟基磷灰石样品，经过超声分散、离心、冷冻干燥等处理后没有对羟基磷灰石的化学结构造成改变，且加标浓度为0.1%时，经过一系列提取处理后，加标空白样品中仍能检测出羟基磷灰石标准品。由此，加标试验验证了超声分散、离心、冷冻干燥等步骤提取奶粉中的羟基磷灰石，利用X射线粉末衍射仪测定羟基磷灰石的方法可行。

图2、3可以看出添加了羟基磷灰石标准品后的空白样品S2经1.3.4步骤处理后提取到的成分，在电子显微镜下能观察到纳米针状羟基磷灰石标准品，透射电子显微镜下能清楚地看到添加到空白样品中的羟基磷灰石标准品的形态(针状)和尺寸(20 nm左右)。

*代表衍射峰

Figure 1 X-ray diffraction patterns of dominant mineral content separated from blank added labeling sample and hydroxyapatite standard reference

图2 空白样品S2加HA标品提取的矿物质成分

Figure 2 SEM of dominant mineral content separated from blank sample S2 added hydroxyapatite standard reference

图3 空白样品S2加HA标品提取的矿物质成分

Figure 3 TEM of dominant mineral content separated from blank sample S2 added hydroxyapatite standard reference

2.2 奶粉样品检测

2.2.1 X射线粉末衍射 5种奶粉样品的X射线粉末衍射图如图4所示。从图4中可以看出，S1的X射线衍射图在25°～26°时的1个角度和30°～35°时的3个角度均出现了衍射特征峰，与羟基磷灰石标准品的特征峰对应的特征衍射角度相近，可以初步推断奶粉样品S1中含有羟基磷灰石这种物质。而奶粉样品S2、S3、S4和S5的X射线衍射图中没有出现羟基磷灰石标准品对应的特征衍射峰，因此不含有羟基磷灰石。奶粉样品S3、S4和S5的衍射图相似，都在29°～30°时出现了特征衍射峰，对比ICDD数据库中方解石01-081-2027标准物质的衍射图，可以初步确定样品S3、S4和S5中含有碳酸钙的方解石晶体。由图4可知，未经超声、离心处理的奶粉样品的XRD粉末衍射图中没有出现尖的衍射峰，而是无定形样品的小鼓包，说明奶粉样品直接做XRD粉末衍射测试时，其中的晶态成分会被无定形的成分裹住而干扰了晶态成分的衍射。

*代表衍射峰

Figure 4 X-ray diffraction patterns of dominant mineral content separated from sample S1～S5 and hydroxyapatite standard reference

2.2.3 电子显微镜观察 奶粉样品S1提取物在透射电子显微镜下未能观察到针状纳米尺寸的羟基磷灰石，但含有未知结构的类似于球状的纳米成分(图6)，能谱仪(Energy Disperse Spectroscopy，EDS)结果显示该纳米颗粒的元素组成为C、O、P、Cl(图7)，因羟基磷灰石结构中钙、磷元素的含量应较多，与图7中纳米颗粒的元素组成比例不同，可见该纳米成分并非羟基磷灰石，其具体结构有待进一步深入研究。

图5 样品S2、S3中提取的矿物质成分和羟基磷

Figure 5 FTIR spectra of dominant mineral content separated from S2, S3 and hydroxyapatite standard reference

图6 样品S1提取的矿物质成分TEM图

图7 样品S1提取的矿物质成分TEM图及EDS图

3 结论

针状纳米羟基磷灰石的安全性存在着一定的争议，本研究通过超声分散、离心、冷冻干燥，分离提取奶粉中富含无机物的成分，利用X射线粉末衍射仪对提取物进行定性分析，并用电子显微镜观察提取物尺寸和形态；所检测的奶粉样品中，样品S1中含有羟基磷灰石(非纳米尺寸)，并含有类似球状未知结构的纳米成分(元素组成为C、O、P、Cl)，样品S2未发现含有晶体状羟基磷灰石，初步确定样品S3、S4、S5含有碳酸钙的方解石晶体。由于纳米成分的小尺寸效应等使得其理化性质不同于常规尺寸的物质；奶粉(特别是婴幼儿奶粉)的安全性直接影响着婴儿的健康，对于奶粉中纳米尺寸成分的检测需要引起学者的更多关注。

由于EDS只能确定样品中的元素组成及各元素所占比例，本研究未能对S1中出现的球状纳米成分进行定性分析；对于其他样品中可能存在的纳米成分分析同样可选择本研究的方法进行探究，同时根据样品中可能存在的纳米尺寸物质进行排查筛选。