蛋黄卵磷脂中两种溶血磷脂的分离与结构鉴定

王国财，袁 诚，唐顺之,关伟键，牟肖男，牛亚伟，傅玉萍，许文东

(广州白云山汉方现代药业有限公司 中药提取分离过程现代化国家工程研究中心，广州 510006)

蛋黄卵磷脂是一种从鸡蛋黄中精制而得的天然磷脂混合物，被广泛应用于脂肪乳、脂质体等特殊注射剂中[1]。研究表明，蛋黄卵磷脂除了含有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)、磷脂酰肌醇(PI)外，还含有两种微量的溶血磷脂，即溶血磷脂酰胆碱(LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)[2-5]。

蛋黄卵磷脂中的微量成分LPC和LPE具有较强的表面活性，在浓度较高时能够使红细胞膜破裂，引起溶血或细胞坏死。因此，中/长链脂肪乳注射液、丙泊酚注射液等脂肪乳制剂均将LPC、LPE作为影响其质量的主要杂质来控制[6-9]。目前，对于蛋黄卵磷脂中的LPC和LPE的含量测定有较多报道[2-5, 10]，但是对于其结构鉴定鲜有报道。

本文通过柱层析法对蛋黄卵磷脂中的LPC和LPE进行分离纯化，利用核磁共振氢谱、碳谱，气相色谱，ESI质谱等鉴定手段，最终确定LPC和LPE的结构，为蛋黄卵磷脂的质量研究及溶血磷脂在临床及用药安全方面提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

蛋黄卵磷脂(广州白云山汉方现代药业有限公司)，柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)，三氯甲烷、甲醇、三氟化硼、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠等均为分析纯，棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、棕榈油酸甲酯、PC、PE、PI、SM、LPE、LPC等标准品均从Sigma-Aldrich公司购买。

1.1.2 仪器与设备

Bruker AVANCE AV 500超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪，Agilent 6890N气相色谱仪，5973N质谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 LPC和LPE的分离纯化

取1 kg蛋黄卵磷脂，加适量三氯甲烷溶解后，进行硅胶柱层析，用薄层板点板与标准品对比收集馏分，先用氯仿-甲醇(体积比5∶1)洗脱液进行洗脱，待第一个馏分(PE)洗脱完全后，收集第二个馏分，浓缩得LPE(8 g)。再用氯仿-甲醇(体积比3∶1)洗脱液进行洗脱，待第三个和第四个馏分(PC和SM)洗脱完后，最后用甲醇进行洗脱，收集第五个馏分，浓缩得LPC(30 g)。

1.2.2 ESI质谱条件

依据JY/T 003—1996《有机质谱分析方法通则》进行ESI质谱测定。电子能量70 eV，离子源温度250℃，检测器电压1 200 V，仪器分辨本领为单位质量分辨，扫描范围(m/z)50～2 000。

1.2.3 核磁共振氢谱和碳谱条件

依据JY/T 007—1996《超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱方法通则》进行核磁共振氢谱和碳谱测定。溶剂为氘代氯仿，氢谱内标为四甲基硅烷。

1.2.4 LPC和LPE脂肪酸组成检测

1.2.4.1 甲酯化

取0.1 g样品，置于50 mL锥形瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钠甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加热回流30 min，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在65℃水浴中加热回流30 min，放冷，加4 mL庚烷，继续在65℃水浴中加热回流5 min后，放冷，加饱和氯化钠溶液10 mL，摇匀，静置分层，取上层液，用水洗涤3次，每次2 mL，上层液经无水硫酸钠干燥后，用微孔滤膜过滤。备用。

1.2.4.2 气相色谱条件

BPX-70毛细管脂肪酸分析柱(30.0 m×25 μm，0.25 μm)，柱温190℃；进样口温度210℃；氢火焰离子化检测器温度300℃，氮气流速1.2 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速400 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 LPC结构鉴定

2.1.1 LPC质谱及核磁数据

所分离得到的LPC性状为白色粉末。

ESI-MSm/z:495.3，506.3，519.3，523.4；[M+H]+m/z：496.4，520.5，524.4；[M+Cl]-m/z：530.3，541.4，554.5，558.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.85～0.89(3H，m，H-a)，1.25(2H，m，H-b，H-g)，1.57(2H，m，H-h)，2.00～2.05(2H，m，H-c，H-f)，2.28～2.31(2H，m，H-i)，3.33(3H，s，H-p)，3.65(2H，m，H-o)，3.80+3.93(2H，m，H-m)，3.93(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，5.33～5.37(2H，m，H-d，H-e)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz)：δ14.1(C-a)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～31.9(C-b，C-g)，34.2(C-i)，54.2(C-p)，59.4(C-n)，65.2(C-k)，66.1(C-o)，67.1(C-m)，68.8(C-l)，127.9～130.2(C-d，C-e)，173.4(C-j)。

根据上述质谱及核磁信息可鉴定该化合物为LPC，其化学结构如图1所示。

图1 溶血磷脂酰胆碱(LPC)化学结构

2.1.2 LPC总脂肪酸检测

通过与脂肪酸甲酯标准品保留时间对比分析，LPC中主要脂肪酸组成为棕榈酸(55.38%)、硬脂酸(25.34%)、油酸(14.26%)、亚油酸(3.95%)、棕榈油酸(1.08%)。

2.1.3 LPC结构确证

由于LPC化学结构上只有1个脂肪酸残基，并通过脂肪酸组成确定了LPC含有5种脂肪酸成分，基本确立了LPC的5种可能结构构型，在此基础上通过ESI质谱进一步确证，其质谱上显示出m/z495.3、506.3、519.3、523.4主要的分子离子峰，表明LPC的化学结构为1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、1-亚油酰溶血磷脂酰胆碱、1-硬脂酰溶血磷脂酰胆碱、1-油酰溶血磷脂酰胆碱4种结构，其中以1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱为主。

2.2 LPE结构鉴定

2.2.1 LPE质谱及核磁数据

所分离得到的LPE性状为白色粉末。

ESI-MSm/z:452.1，478.0，480.0；[M+H]+m/z：481.1。

1H-NMR(CDCl3,500 MHz):δ0.88(3H，m，H-a)，1.29(2H，m，H-b，H-g)，1.58(2H，m，H-h)，2.36(2H，m，H-i)，3.25(2H，m，H-o)，3.86+4.00(2H，m，H-m)，3.96(1H，m，H-l)，4.06～4.07(2H，m，H-k)，4.31(2H，m，H-n)，7.96(2H，m，H-p)。13C-NMR(CDCl3，150 MHz):δ14.1(C-a)，22.7(C-b)，24.9(C-h)，27.20(C-c，C-f)，22.7～32.0(C-b，C-g)，34.0(C-i)，40.2(C-o)，62.2(C-n)，64.9(C-k)，67.1(C-m)，68.5(C-l)，173.4(C-j)。通过与LPC的氢谱碳谱进行比较可知，LPE并没有氮甲基信号(δH3.33与δC54.2)，而且存在氮质子信号(δH7.96)。

结合质谱信息及核磁数据可鉴定该化合物为LPE，其化学结构如图2所示。

图2 溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)化学结构

2.2.2 LPE总脂肪酸检测

通过与脂肪酸甲酯标准品保留时间对比分析，LPE中主要脂肪酸组成为棕榈酸(22.41%)、硬脂酸(67.25%)、油酸(7.44%)。

2.2.3 LPE结构确证

由于LPE化学结构上只有1个脂肪酸残基，并通过脂肪酸组成确定了LPE含有的3种脂肪酸成分，基本确立了LPE的3种可能化学结构，在此基础上通过ESI质谱进一步进行确证，其质谱上具有m/z452.1、478.0、480.0分子离子峰，表明LPE的结构为1-棕榈酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3种结构，其中以1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺为主。

3 结 论

本文以柱层析分离法对蛋黄卵磷脂中两种溶血磷脂(LPC和LPE)进行分离纯化，采用ESI质谱、气相色谱、核磁共振对其进行结构鉴定，最终确定蛋黄卵磷脂中的LPC具有1-棕榈酰溶血磷脂酰胆碱、1-亚油酰溶血磷脂酰胆碱、1-硬脂酰溶血磷脂酰胆碱和1-油酰溶血磷脂酰胆碱4种结构，LPE具有1-棕榈酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰溶血磷脂酰乙醇胺、1-油酰溶血磷脂酰乙醇胺3种结构。