虹鳟鱼油的超声波辅助法提取及其脂肪酸组成分析

赵保堂，孙 栋，刘 东，刘倩霞，杨富民，张 继

(1.甘肃农业大学 食品科学与工程学院，兰州 730070； 2.甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，兰州 730070)

虹鳟鱼是世界名贵鱼种之一，在我国广泛养殖[1]。虹鳟鱼肉质细嫩，含脂量多，维生素D、铁元素含量远高于其他食品，而且油脂不饱和脂肪酸含量较高，食用后可降低人体血脂水平和软化血管，可用于预防心脏病、高血压等，并可促进大脑与视网膜发育[2]。因此，虹鳟鱼油的的研究开发具有良好的市场前景。

超声波是一种高频率的机械振荡波，通过产生空穴效应强化萃取效果和萃取效率[3]。杨小克[4]研究了鱿鱼内脏油脂的提取方法、脂肪酸组成及理化性质，在提高鱼油提取率的同时，明确提取方法对脂肪酸组成及理化性质的影响。魏永生等[5]对虹鳟鱼肌肉脂肪酸进行了GC-MS分析，其中不饱和脂肪酸含量较高，含有丰富的亚麻酸。孙丽霞等[6-7]采用响应面法优化超声辅助提取罗非鱼内脏油脂工艺，并用不同方法提取了罗非鱼内脏油脂和对脂肪酸组成进行分析，结果表明超声辅助提取法可缩短鱼油提取时间，减少溶剂用量，提高鱼油提取率。

目前，国内外对鱼油的提取分析有很多的文献报道，但对于虹鳟鱼油的超声辅助提取研究鲜有报道。本文以虹鳟鱼内脏为原料，以石油醚为提取溶剂，比较分析超声功率、超声时间、超声温度、提取次数、液料比对鱼油提取率的影响。在单因素实验基础上，以鱼油提取率为指标，通过响应面分析法优化工艺条件，获得超声波辅助法提取虹鳟鱼油的最佳工艺条件，并对虹鳟鱼油的脂肪酸组成、过氧化值、酸价等进行分析，为后续的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

虹鳟鱼内脏：购于兰州市永登县，去除胆囊及肠道内消化物，洗净沥干，并用绞肉机绞碎成糜状，冷藏备用。

无水乙醇、甲醇、异辛烷，均为色谱纯；乙醚、石油醚(沸程60～90℃)、氢氧化钾、盐酸、硫酸氢钠、硫酸钠、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

GC-MS 6800气相色谱-质谱联用仪：江苏天瑞仪器股份有限公司；SB-5200DTS超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；FA1104N电子分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；RE-52C旋转蒸发仪：上海青浦沪西仪器厂；循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虹鳟鱼内脏含油量测定

准确称取虹鳟鱼内脏5.0 g，用滤纸包裹严实，置于索氏抽提器中，加入石油醚使包裹物完全浸没在石油醚中，水浴加热圆底烧瓶提取8 h，将提取后的液体用分液漏斗分离水分后，减压蒸发挥去石油醚，称量产物质量，计算虹鳟鱼内脏的含油量。

1.2.2 虹鳟鱼油的超声波辅助提取

准确称取虹鳟鱼内脏5.0 g置于50 mL锥形瓶中，根据实验条件加入石油醚，设定好超声仪器条件置于其中，超声完毕后抽滤去除残留物，将提取后的液体用分液漏斗分离水分后，转入旋转蒸发仪挥去石油醚，称量鱼油质量，计算虹鳟鱼油的提取率。以虹鳟鱼油提取率为指标，考察超声时间、液料比、超声功率、提取次数、超声温度对虹鳟鱼油提取率的影响，每组实验重复3次，取平均值。

虹鳟鱼油提取率=提取的鱼油质量/内脏含鱼油质量×100%

1.2.3 酸价和过氧化值的测定

分别按照GB 5009.229—2016、GB 5009.227—2016测定虹鳟鱼油的酸价、过氧化值。

1.2.4 脂肪酸组成的测定

脂肪酸甲酯的制备：参考张静等[8]的方法制备脂肪酸甲酯。

GC条件：RTX-5MS 型弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温为柱温160℃，保留2 min，然后以5℃/min 升至210℃，保持3 min，再以1℃/min 升至220℃，保持1 min，最后以5℃/min 升至250℃，保持1 min；进样量2.5 μL。

MS条件：离子源为EI源，离子源温度250℃，传输线温度250℃。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声温度对虹鳟鱼油提取率的影响

在超声时间30 min、液料比10∶1、超声功率150 W、提取次数1次的条件下，考察超声温度(20、30、40、50、60℃)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果如图1所示。

图1 超声温度对提取率的影响

由图1可知，随着超声温度的升高，提取率呈现增大的趋势，当超声温度为50℃时，提取率达到最大，之后提取率开始下降。这是因为在超声温度升高的过程中增加了溶剂分子和油脂分子的动能，使扩散运动能够进行，进而鱼油的提取率升高，此后升高超声温度对提取率无显著作用[9]。因此，最佳超声温度确定为50℃。

2.1.2 超声时间对虹鳟鱼油提取率的影响

在超声温度50℃、液料比10∶1、超声功率150 W、提取次数1次的条件下，考察超声时间(10、20、30、40、50、60 min)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果如图2 所示。

图2 超声时间对提取率的影响

由图2可知，随着超声时间的延长，提取率呈现增大的趋势，当超声时间超过50 min时，提取率变化不大。这可能是因为随着超声时间的延长，在超声波的空穴效应下，虹鳟鱼内脏中越来越多结缔组织被打断，将更多鱼油释放出来；但虹鳟鱼内脏中的鱼油是有限的，当释放到一定程度后，随超声时间延长虹鳟鱼油提取率增大不显著[10]。因此，最佳超声时间确定为50 min。

2.1.3 液料比对虹鳟鱼油提取率的影响

在超声时间50 min、超声功率150 W、提取次数1次、超声温度50℃的条件下，考察液料比(4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果如图3所示。

图3 液料比对提取率的影响

由图3可知，随着液料比的增加，提取率呈现增大的趋势，当液料比为10∶1时，提取率最大。液料比的大小决定了提取溶剂与虹鳟鱼内脏接触程度的大小，液料比增大增加了虹鳟鱼内脏与溶剂间的浓度差，提高了油脂向溶剂扩散的速率，从而使提取率增大，当溶剂与鱼油的比率达到饱和时，液料比将不再影响提取率[11]。因此，最佳液料比确定为10∶1。

2.1.4 超声功率对虹鳟鱼油提取率的影响

在超声时间50 min、液料比10∶1、提取次数1次、超声温度50℃的条件下，考察超声功率(100、125、150、175、200、225、250 W)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果如图4所示。

图4 超声功率对提取率的影响

由图4可知，随着超声功率的增加，提取率呈现增大的趋势，当超声功率为175 W时，提取率达到最大，之后提取率开始下降。这是由于超声功率的强度对提取率有着决定性作用，超声功率越大，空化作用与机械作用越激烈，界面扩散层上的分子扩散越快，但是超声功率过大，超声波的传播衰减将增大，导致提取率增加缓慢甚至下降[12-13]。因此，最佳超声功率确定为175 W。

2.1.5 提取次数对虹鳟鱼油提取率的影响

在超声时间50 min、液料比10∶1、超声功率175 W、超声温度50℃条件下，考察提取次数(1、2、3、4次)对虹鳟鱼油提取率的影响，结果如图5所示。

图5 提取次数对提取率的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，提取率呈现逐渐上升的趋势，这主要是由于随着提取次数的增加，石油醚与鱼油的结合次数增加，使虹鳟鱼内脏中的鱼油充分释放，提取率逐渐变大，但过多的提取次数使后续处理步骤增加，不利于工业化生产，且提取次数的增加对提取率的增加影响不显著[14]。因此，在后续实验中提取次数确定为1次。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面优化实验设计

以单因素实验为基础，选取液料比(X1)、超声时间(X2)、超声温度(X3)和超声功率(X4)4个因素进行响应面优化设计，考察其对虹鳟鱼油提取率的影响，以优化虹鳟鱼油提取工艺条件，响应面实验因素与水平如表1所示。

表1 响应面实验因素与水平

2.2.2 统计分析和模型拟合

采用Box-Behnken实验设计，响应面实验设计及结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果

对表2中数据进行回归拟合，得到虹鳟鱼油提取率(Y)对液料比(X1)、超声时间(X2)、超声温度(X3)和超声功率(X4)的二次多项回归方程为：

运用Design-ExpertV8.0软件对表2中数据进行分析，得到虹鳟鱼油提取率回归方程的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

注：P<0.000 1，差异高度显著，用**表示；P<0.05，差异显著，用*表示。

2.2.3 验证实验

采用将回归方程各自应变量取一阶偏导为零，得到的超声波辅助法最佳提取条件为提取次数1次、超声功率199.97 W、超声时间57.8 min、超声温度54.62℃、液料比11.98∶1。为了实际操作的便利，取超声波辅助法最佳工艺条件为提取次数1次、超声功率200 W、超声时间58 min、超声温度55℃、液料比12∶1。在此基础上对优化后的工艺条件进行验证实验，重复3次取平均值，虹鳟鱼油提取率为95.10%。

所得虹鳟鱼油为棕黄色，稍有浑浊沉淀，具有一般鱼油的腥味，其酸价(KOH)为3.708 mg/g、过氧化值为1.516 mmol/kg,均符合SC/T 3502—2016粗鱼油一级标准，可作为一种较好的食用油脂。

2.3 虹鳟鱼油脂肪酸组成

超声波辅助法提取的虹鳟鱼油脂肪酸组成测定结果如表4所示。

表4 虹鳟鱼油脂肪酸组成

由表4可知，超声波辅助法提取所得虹鳟鱼油主要有8种脂肪酸，包括12-甲基-十三烷酸、软脂酸、亚油酸、亚麻酸、油酸、硬脂酸、EPA、DHA，其中亚油酸是主要的多不饱和脂肪酸，亚油酸含量为26.42%，亚麻酸含量为9.24%，EPA含量为1.12%，DHA含量为4.45%。单不饱和脂肪酸是油酸，含量为20.09%。因此，可以将虹鳟鱼作为多不饱和脂肪酸的来源，其在营养保健和药用领域将会有良好的发展前景[15]。

3 结 论

采用超声波辅助法提取虹鳟鱼油，采用单因素实验考察了超声温度、超声功率、超声时间、提取次数及液料比对虹鳟鱼油提取率的影响。在单因素实验基础上采用响应面法优化虹鳟鱼油超声波辅助法提取工艺条件，得到最佳工艺条件为提取次数1次、超声功率200 W、超声时间为58 min、超声温度55℃、液料比12∶1，在此条件下虹鳟鱼油提取率为95.10%。虹鳟鱼油酸价和过氧化值符合粗鱼油一级标准(SC/T 3502—2016)。虹鳟鱼油中亚油酸、亚麻酸、EPA、DHA含量分别为26.42%、9.24%、1.12%和4.45%，油酸含量为20.09%。