桂花果实油脂的不同提取方法工艺优化及脂肪酸组成

张 蝶，王苗苗，李桂华，刘嘉琪，何国威，刘 建，唐伟卓

(长沙学院 生物与环境工程学院，长沙 410022)

桂花(OsmanthusfragransL.)为我国的十大传统名花之一，主要分布在我国南方，并被广泛种植。受自然环境和种质遗传的影响，桂花品种种类繁多，如金桂(Osmanthusfragransvar. thunbergii Makino)、银桂(Osmanthusfragransasiaticus Nakai)、丹桂(Osmanthusfragransvar.Auranticaus) 和四季桂(Osmanthusfragransvar.Semperflorens)[1-3]。桂花果实油脂含量丰富，果实含油量可达11%，具有开发成为新型油脂原料的潜力。

我国作为桂花的主要产区，拥有大量的桂花果实资源[4]。现阶段桂花果实的应用除了少数作为种质资源进行桂花育苗和观赏栽培外[5-6]，多数没有得到充分利用，造成了巨大的浪费。据文献查询，已有部分研究者对桂花果实油脂中脂肪酸类成分进行了提取分析[7-8], 但是利用不同提取方法提取并比较桂花果实油脂得率的研究鲜见报道。因此，本文采用3种提取方法(快速溶剂提取、超声辅助提取、回流提取)优选桂花果实油脂的提取工艺，确定桂花果实油脂提取的最佳提取方法和工艺参数；同时对桂花4个品种(金桂、银桂、丹桂和四季桂)果实油脂得率进行比较，筛选制备桂花果实油脂的最佳品种；进一步对制备的最佳品种果实油脂的脂肪酸组成进行分析，为桂花果实资源的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

桂花4个品种(金桂、银桂、丹桂和四季桂)去皮干燥果实(含水量为7.8%)，2017年7月购自江苏省宿迁市，经长沙学院陈建荣副教授鉴定为木犀属植物桂花的成熟果实。

甲醇、正己烷均为色谱纯，德国Merck公司；石油醚(60～90℃)、甲醇均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；5种脂肪酸标准品(纯度>98%)，青岛科创质量检测有限公司。

1.1.2 仪器与设备

HPSEgemini-EVS快速溶剂提取仪；103B型高速中药粉碎机；TMT-3型电子天平；HWS-28型电热恒温水浴锅；RE-52AA型旋转蒸发器；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵；101A-2B型电热鼓风干燥箱；Thermo Fisher Trace 1310 ISQ气相色谱质谱联用仪，美国 Thermo Fisher Scientific。

1.2 实验方法

1.2.1 桂花果实油脂的快速溶剂提取

桂花果实(四季桂)粉碎过60目筛，精密称取4.00 g桂花果实粉末，与适量的硅藻土混合，转移至萃取管内，备用。以正己烷为溶剂，待调节好提取温度、提取压力和提取时间后开始提取，最终收集提取液120 mL，过滤回收，得桂花果实油脂提取物，烘干至恒重后，称重，计算油脂得率。

1.2.2 桂花果实油脂的回流提取

将桂花果实(四季桂)粉碎并过60目筛，精密称取4.00 g桂花果实粉末至圆底烧瓶内，加入一定量的石油醚，置于电热恒温水浴锅内进行提取，提取2次，合并提取液，回收溶剂，得桂花果实油脂提取物，干燥至恒重，称重，计算油脂得率。

1.2.3 桂花果实油脂的超声辅助提取

将桂花果实(四季桂)粉碎并过60目筛，精密称取4.00 g桂花果实粉末至锥形瓶内，加入一定量的石油醚，置于超声仪进行提取，提取2次，合并提取液，回收溶剂，得桂花果实油脂提取物，干燥至恒重，称重，计算油脂得率。

1.2.4 桂花果实油脂提取工艺条件实验设计[9]

1.2.4.1 快速溶剂提取法单因素实验设计

为考察提取时间、提取温度、提取压力对桂花果实油脂得率的影响，单因素实验分别设置为提取时间(2、4、6、8、10 min)、提取温度(89、92、94、96、99℃)、提取压力(5、7、9、11、13 MPa)各5个梯度水平进行实验。在进行某一单因素考察时，保持其他两个因素水平一致。设置的固定因素水平分别为提取时间6 min、提取温度94℃、提取压力9 MPa。

1.2.4.2 回流提取法单因素实验设计

为考察回流时间、回流温度、料液比对桂花果实油脂得率的影响，单因素实验分别设置为回流时间(30、60、90、120、150 min)、回流温度(65、70、75、80、85℃)、料液比(1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21)各5个梯度水平进行实验。在进行某一单因素实验时，保持其他两个因素水平一致。设置的固定因素水平分别为回流时间90 min、回流温度75℃、料液比1∶13。

1.2.4.3 超声辅助提取法单因素实验设计

为考察超声温度、超声时间、料液比对桂花果实油脂得率的影响，单因素实验分别设置为超声时间(10、20、30、40、50 min)、超声温度(40、45、50、55、60℃)、料液比(1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21)各5个梯度水平进行实验。在进行某一单因素实验时，保持其他两个因素水平一致。设置的固定因素水平分别为超声时间30 min、超声温度50℃、料液比1∶13。

1.2.4.4 正交实验优化

经上述各种提取方法的单因素实验结果分析后，以桂花果实油脂得率作为考察指标，进行L9(33)正交优化实验。

1.2.5 桂花果实油脂的脂肪酸组成分析

1.2.5.1 甲酯化

准确称取桂花果实油脂样品1.0 g于圆底烧瓶中，加入5%氢氧化钾-甲醇溶液 (2 mL)，于40℃恒温水浴20 min。待反应完成后，冷却至室温，加入正己烷(2 mL)溶解，并转移至10 mL容量瓶中定容。静置24 h，吸取上层有机相，经0.45 μm有机滤膜过滤，待GC-MS检测。

1.2.5.2 GC-MS分析条件

GC条件：TG-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；以高纯氦气(99.999%)为载气，流速1.2 mL/min;升温程序为初始温度80℃，保持1 min，随后以10℃/min 升温至200℃，再以5℃/min 升温至250℃，最后以2℃/min升温至270℃，保持3 min；进样口温度 290℃；进样量1 μL；不分流进样，开阀时间1 min。

MS条件:EI电离源；电离源温度280℃；溶剂延时5 min；电子轰击能量70 eV；扫描范围30～400；分辨率1 000。

2 结果与讨论

2.1 桂花果实油脂提取单因素实验

2.1.1 快速溶剂提取法单因素实验(见图1)

图1 快速溶剂提取法不同因素对桂花果实油脂得率的影响

由图1可知，提取时间、提取温度、提取压力对桂花果实油脂得率均有明显影响。在快速溶剂提取工艺下，油脂得率随着提取时间、提取温度、提取压力的增加而逐渐增加。在提取时间大于6 min、提取温度高于94℃、提取压力大于9 MPa后，油脂得率略有降低。基于能效和成本考虑，选择提取时间6 min、提取温度94℃、提取压力9 MPa为基础进行后续正交实验。

2.1.2 回流提取法单因素实验(见图2)

图2 回流提取法不同因素对桂花果实油脂得率的影响

由图2可知，回流时间、回流温度、料液比对桂花果实油脂得率均有明显的影响。在回流提取工艺下，油脂得率随着回流时间、回流温度、料液比的增加而逐渐增加。在回流时间大于60 min、回流温度高于75℃、料液比大于1∶13后，油脂得率略有降低。基于能效和成本考虑，选择回流时间60 min、回流温度75℃、料液比1∶13为基础进行后续正交实验。

2.1.3 超声辅助提取法单因素实验(见图3)

图3 超声辅助提取法不同因素对桂花果实油脂得率的影响

由图3可知，超声时间、超声温度、料液比对桂花果实油脂得率均有明显的影响。在超声辅助提取工艺下，油脂得率随着超声时间、超声温度、料液比的增加而逐渐增加。在超声时间大于30 min、超声温度高于55℃、料液比大于1∶13后，油脂得率略有降低。基于能效和成本考虑，选择超声时间30 min、超声温度55℃、料液比1∶13为基础进行后续正交实验。

2.2 桂花果实油脂提取正交实验

2.2.1 桂花果实油脂快速溶剂提取正交实验

在2.1.1单因素实验基础上，对桂花果实油脂的快速溶剂提取进行正交实验，因素水平见表1，正交实验设计及结果见表2。

表1 快速溶剂提取法因素水平

表2 桂花果实油脂快速溶剂提取正交实验设计及结果

由表2可知，在快速溶剂提取法下，提取时间对油脂得率影响最大，其次为提取压力和提取温度。最佳提取因素水平组合为A1B3C3，即提取压力为7 MPa、提取温度为96℃、提取时间为8 min。

2.2.2 桂花果实油脂回流提取正交实验

在2.1.2单因素实验基础上，对桂花果实油脂的回流提取进行正交实验，因素水平见表3，正交实验设计及结果见表4。

表3 回流提取法因素水平

表4 桂花果实油脂回流提取正交实验设计及结果

由表4可知，在回流提取工艺下， 各因素对桂花果实油脂得率的影响大小依次为C>B>A。参考表4中的油脂得率，确定最佳提取因素水平组合为A1B2C2，即回流时间为30 min、回流温度为80℃、料液比为1∶13。

2.2.3 桂花果实油脂超声辅助提取正交实验

在2.1.3单因素实验基础上，对桂花果实油脂的超声辅助提取进行正交实验，因素水平见表5，正交实验设计及结果见表6。

表5 超声辅助提取法因素水平

表6 桂花果实油脂超声辅助提取正交实验设计及结果

由表6可知，在超声辅助提取工艺下各因素对桂花果实油脂得率的影响大小依次为C>A>B。最佳提取因素水平组合为A1B2C2，即超声时间为20 min、超声温度为55℃、料液比为1∶13。

2.3 验证实验

对桂花果实油脂3种提取方法的最佳工艺条件进行验证实验，结果如表7所示。

表7 桂花果实油脂3种提取方法最佳工艺结果比较

由表7可知，3种提取方法中，快速溶剂提取法的油脂得率最高，确定为桂花果实油脂提取的最适方法。

2.4 不同品种桂花果实油脂得率比较

采用快速溶剂提取法的最佳提取工艺条件，对桂花4个品种果实的油脂得率进行比较分析。结果如表8所示。

表8 最佳工艺提取下不同品种桂花果实油脂得率比较

由表8可知，桂花4个品种果实中，四季桂品种果实油脂得率最高，可以确定为桂花果实油脂制备的最适品种。

2.5 四季桂果实油脂脂肪酸组成

采用NIST05标准谱库对分析的样品进行峰匹配，逐一对应进行定性分析，采用混合标准品和面积归一化法进行定量分析。四季桂果实油脂脂肪酸组成及相对含量见表9。

表9 四季桂果实油脂脂肪酸组成及相对含量 %

由表9可知，四季桂果实油脂中共检出18种脂肪酸成分，主要成分为顺-10-十五碳烯酸、硬脂酸、油酸、亚油酸。其中，单不饱和脂肪酸相对含量达57.14%，以油酸为主(43.16%)；多不饱和脂肪酸相对含量达38.34%，以亚油酸为主(38.02%)。

3 结 论

本文以油脂得率作为考核指标，采用单因素实验和正交实验优选了桂花果实油脂的不同提取方法(快速溶剂提取、超声辅助提取和回流提取)的工艺，通过比较，确定了快速溶剂提取法为桂花果实油脂提取的最佳方法，其最佳工艺条件为提取时间8 min、提取压力7 MPa、提取温度96℃，此条件下桂花果实油脂得率为29.8%。此外，对桂花4个品种果实的油脂得率进行比较分析，确定四季桂品种果实为桂花果实油脂的最适制备原料。经GC-MS分析，四季桂果实油脂中含18种脂肪酸，主要为油酸、亚油酸、硬脂酸、顺-10-十五碳烯酸，其中不饱和脂肪酸含量较高，单不饱和脂肪酸含量为57.14%，主要以油酸为主；多不饱和脂肪酸含量为38.34%，主要以亚油酸为主。