逆电针少阳经特定穴对偏头痛大鼠50%缩足阈值及血清中CGRP、SP含量的影响*

刘秋佳 叶意红 王乾娜 刘未艾△ 陈建宏 贺新民

（1.湖南中医药大学第二中医临床学院，湖南 长沙 410005；2.湖南中医药大学附属衡阳医院，湖南 衡阳 421000）

“逆针灸”是指在无病或将病未病之时，预先应用电针方法激发经络之气，以增强抗病能力的针灸方法，属于中医治未病范畴。明·高武《针灸聚英》提出“无病而先针灸曰逆，逆，未至而迎之也”。欲病救萌，防微杜渐，“逆电针”即循用逆针灸配合电针的方法。

偏头痛是一种反复发作的头痛疾患，呈一侧或双侧疼痛，常伴有恶心、呕吐，少数病例发作前可伴有视觉、感觉先兆，致残率高，疾病负担重。《全球疾病负担（GBD）研究报告》显示，偏头痛的全球患病率高达14.7%，是世界三大常见疾病之一，且高居世界致残性疾病第6位［1-2］。目前临床上的治疗手段如西药或外科手术可取得一定的疗效，但不良反应较多［3］。针刺具有良好的即时镇痛和远期效应，在防治偏头痛中不可或缺；近年来，国内外的多中心、大样本的临床随机对照试验证实，针刺防治偏头痛发作疗效确切［4-5］。研究表明，偏头痛发作时患者外周血中降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）等神经递质的水平会发生不同的变化，而且这些变化可能与偏头痛的发生、持续等有关［6-7］。本课题组在前期研究中发现电针少阳经特定穴可以有效改善偏头痛症状及头痛程度［8-10］。然而，逆电针治疗是否可以有效预防偏头痛的发生或缓解急性偏头痛发作时的疼痛程度，目前尚未见相关报道。本研究通过观察逆电针少阳经特定穴对偏头痛模型大鼠的50%PWT及血清中CGRP、SP含量的影响，探讨预防性给予电针少阳经特定穴对改善偏头痛程度和促进偏头痛症状恢复的作用及其可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级SD大鼠60只，体质量200～250 g，雌雄各半，月龄 3～4 月，购于湖南中医药大学动物实验中心，许可证编号：SCXK（湘）2013-0005。饲养温度20～25℃，湿度50%～70%，适应性喂养3 d后进行实验。

1.2 药剂与仪器 硝酸甘油注射液（规格5 mg/mL，批号国药准字H20057216，河南润弘制药有限公司）；降钙素基因相关肽（CGRP）试剂盒（生产批号201708，武汉华美生物工程有限公司）；P物质（SP）试剂盒（生产批号201708，武汉华美生物工程有限公司）；台式高速冷冻离心机（货号H1650R，湖南湘仪仪器有限公司）；全自动酶标洗板机（货号PW-812，深圳汇松科技发展有限公司）；多功能酶标分析仪（货号MB-530，深圳汇松科技发展有限公司）；恒温培养箱（货号DHP-500，北京市永光明医疗仪器有限公司）；自动平衡离心机（货号L530，湖南湘仪仪器有限公司）；华佗牌电针仪（型号SDZ-Ⅱ，苏州医疗用品厂有限公司）；华佗牌针灸针（φ0.25×13 mm，生产批号 160230，苏州医疗用品有限公司）；Von Frey针刺痛觉测试仪套件（型号Aesthesio，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；37450-045大型多孔金属平台测试架（规格90 cm×38 cm×40 cm，底部网孔5 mm×5 mm，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；多配置动物围栏（型号37000-006，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 分组与造模 按随机数字表法将60只大鼠随机分为空白组（n=20）、模型组（n=20）、逆电针组（n=20），其中每组又分为造模后30 min组、造模后90 min组，每组各10只。空白组、模型组正常饲养并同电针组同时段捆绑30 min×7 d，逆电针组正常饲养并捆绑行电针治疗30 min×7 d。空白组第8天皮下注射等量0.9%氯化钠注射液，模型组、逆电针组第8天皮下注射硝酸甘油造模，实验动物处置均符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》要求。空白组臀部皮下注射0.9%氯化钠注射液10 mg/kg，其余组参照TASSORELL C等方法按10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油注射剂造模［11］。模型评价：造模约10 min后，大鼠出现双耳发红、挠头、爬笼次数增多、咬尾等活动增加表现，出现以上现象为造模成功。50%PWT评价：使用Von Frey针刺痛觉测试仪［12］，记录引起大鼠四肢缩足反应显示的刺激力，推算50%PWT，以判断偏头痛大鼠的疼痛程度。每组大鼠造模前后对比，如果造模后50%PWT较造模前明显降低，则说明大鼠造模后痛阈降低，对疼痛更敏感，造模成功。电针治疗方法：在捆绑下，参照新世纪全国高等中医院校规划教材《实验针灸学》及华兴邦的大鼠穴位图谱［13］，以华佗牌0.25 mm×13 mm一次性无菌针灸针分别刺入大鼠的双侧“风池”“外关”“阳陵泉”穴，进针1～6 mm之间，行平补平泻手法，捻转角度为180°，频率为120次/min；持续捻转0.5～2 min，行针结束后，电针少阳经特定穴组选取“外关”“阳陵泉”穴，同侧两针柄分别连接电针仪导线的正负极，采用疏密波进行刺激，强度0.5～1.0 mA，频率10/50 Hz，每次 30 min。

1.4 标本采集与检测 1）血液样品的收集与处理：50%PWT测定结束后，以20%乌拉坦4 mL/kg腹腔内注射麻醉，予腹主动脉采血，常温放置2～3 h，4℃3 000 r/min，离心15 min，取上清液，-20℃保存待测。2）行为学评分：通过观察并记录偏头痛模型大鼠的行为症状进行评分，包括挠头、爬笼、往返、咬尾等，出现1次计1分。治疗前0～30 min第1次评分（治疗前），造模后0～30 min第2次评分，造模后30～60 min第3次评分，造模后60～90 min第4次评分，造模后90～120 min第5次评分。3）50%PWT测定：参照Chapland等方法，将大鼠置于穿孔金属平台上，以标准动物围栏分笼隔开，使后足底充分暴露［14］。使用Von Frey针刺痛觉测试仪，刺激大鼠同侧后爪趾面的中间区域，观察其后肢缩足反射，记录引起大鼠缩足反应的刺激力及阳性阴性反应序列，通过 Up and Down 法［dixon 法］［12］推算 50%PWT。4）血清中CGRP、SP的测定：采用酶联免疫法（ELISA）检测大鼠血清中CGRP、SP的含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，所有数据都进行正态性和方差齐性检验。满足正态性时，两组计量资料采用两独立样本t检验（Two-sample t-test），多组计量资料采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较若方差齐时采用LSD检验，方差不齐时用Dunnett T3法检验；不满足正态性时选择秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学评分比较 见表1。治疗前，两组大鼠行为学评分差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，与空白组对比，模型组行为学评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；且与治疗前对比，模型组造模后行为学评分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模成功。模型组造模后各组对比，从造模后30～120 min行为学评分呈递减趋势，其中造模后0～30 min与造模后30～60 min对比、造模后60～90 min与造模后90～120 min对比差异均无统计学意义（P＞0.05），其余各组对比均有显著差异（P＜0.01），提示大鼠具有一定的自愈性，且模型组大鼠0～60 min处于较活跃状态，60 min后大鼠趋于安静，分别以造模后30 min及造模后90 min 2个时间点大鼠行为学评分较稳定。

表1 各组大鼠行为学比较（分，x±s）

表1 各组大鼠行为学比较（分，x±s）

与空白组同时间比较，**P＜0.01；与本组造模后0～30 min比较，##P＜0.01；与本组造模后 30～60 min 比较，△△P＜0.01

治疗前 造模后 0～30 min 5.20±1.03 5.70±0.95 5.80±1.14 34.8±2.53**组 别 n 造模后30～60 min造模后60～90 min 造模后90～120 min空白组 10 5.1±1.45 5.50±1.08 5.4±0.84模型组 10 33.70±2.50** 27.2±3.08**##△△ 26.90±3.87**##△△

2.2 各组大鼠50%PWT比较 见表2。治疗前，各组大鼠50%PWT差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，与空白组对比，模型组、逆电针组50%PWT均降低（P＜0.01），提示造模成功；与模型组对比，逆电针组50%PWT均升高（P＜0.01），提示预防性治疗有效。与造模后30 min对比，模型组50%PWT造模后90 min升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示大鼠具有一定的自愈性；逆电针组50%PWT造模后90 min升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示逆电针治疗可以缓解大鼠偏头痛程度，尤以造模后90 min最为显著。

表 2 各组大鼠 50%PWT比较（g，x±s）

表 2 各组大鼠 50%PWT比较（g，x±s）

与空白组同时间比较，**P＜0.01；与模型组同时间比较，##P＜0.01；与本组造模后30 min比较，△P＜0.05

组 别 n 造模后30 min n造模后90 min空白组 20 6.35±1.41 10 6.64±1.04治疗前 n 6.46±1.36 10模型组 20 2.59±0.67** 10 3.18±0.49**△6.35±0.65 10逆电针组 20 6.58±0.86 10 3.60±0.52**## 10 4.22±0.61**##△

2.3 各组大鼠血清中CGRP、SP含量比较 见表3。与空白组比较，模型组CGRP、SP含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01），说明造模后大鼠 CGRP、SP 含量是升高的。与模型组比较，逆电针组CGRP、SP含量呈下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.01），尤其在造模后90 min显著降低。与造模后30 min对比，模型组CGRP、SP含量略有下降，但差异无统计学意义 （P＞0.05）；逆电针组CGRP、SP含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组大鼠不同时间点血清中CGRP、SP含量比较（ng/L，x±s）

表3 各组大鼠不同时间点血清中CGRP、SP含量比较（ng/L，x±s）

与空白组同时间比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组同时间比较，##P＜0.01；与本组造模后 30 min比较，△P＜0.05

组别 时间 CGRP SP空白组 造模后 30 min 13.48±0.89 54.84±3.38（n=10） 造模后 90 min 13.57±0.90 55.08±0.59模型组 造模后 30 min 19.34±1.25** 66.72±4.03**（n=10） 造模后 90 min 19.24±1.33** 65.92±2.35**逆电针组 造模后30 min 16.37±1.26**## 60.67±3.70**##（n=10） 造模后 90 min 14.74±0.94*##△ 57.30±2.04*##△

3 讨 论

头痛与六经密切相关，《冷庐医话·头痛》曰“属少阳者，上至两角，痛在头角”，而偏头痛好发在侧头部，为少阳经循行区域，与手足少阳经密切相关，故治疗的关键在于通利少阳经脉气血，针刺取穴时应以少阳经为主。

在偏头痛的发病机制中，三叉神经血管源性学说是目前解释偏头痛的主流学说，该学说认为偏头痛与三叉神经系统的激活有关。当三叉神经末梢受到有害刺激后，释放神经递质如CGRP、SP等，血管扩张、通透性增加，血浆蛋白等渗出、诱发肥大细胞释放组胺等物质引起神经源性炎症，最终导致头痛的发生［15］。神经肽，主要是降钙素基因相关肽、P物质的释放及神经源性炎症，被认为是偏头痛发生的病理生理学基础［16］。CGRP是一种舒血管神经肽，主要由三叉神经传入纤维产生，具有强烈的扩张血管的作用，是目前公认的偏头痛神经生物学标志物［17］。有研究表明偏头痛发作与三叉神经血管系统的CGRP含量变化有关［18］。SP是第一级伤害性传入纤维末梢释放的神经递质，其直接作用于组织，可有效传递痛觉，引起疼痛［19］。在偏头痛发作初始，神经末梢大量释放SP，血中浓度升高［20］。

通过本实验，我们发现模型组大鼠50%PWT明显降低，行为学评分及CGRP、SP含量均显著高于空白组，与现有结果一致［21-22］。造模后，模型组各组对比，从造模后30～120 min行为学评分大致呈递减趋势，提示大鼠具有一定的自愈性，且分别以造模后30 min及造模后90 min两个时间点行为学评分较为稳定；造模后，逆电针组50%PWT明显高于模型组，提示电针少阳经穴预防性治疗有效，可以一定程度上降低造模后大鼠偏头痛的疼痛程度，其作用机制可能为减少三叉神经末梢对CGRP、SP等神经递质的释放，从而抑制三叉神经血管系统的激活，减轻疼痛程度。与造模后30 min对比，模型组造模后90 min行为学评分明显下降，50%PWT有所升高，CGRP、SP无明显差异，提示大鼠具有一定的疼痛缓解能力，但短时间内不能有效调节血中神经递质的浓度；逆电针组造模后90 min 50%PWT较造模后30 min亦升高，且CGRP、SP含量均低于造模后30 min，提示逆电针少阳经特定穴减轻大鼠偏头痛不依赖于大鼠自愈能力，其可有效调节CGRP、SP的表达，抑制神经源性炎症，从而缓解疼痛。

综上，逆电针少阳经特定穴可以下调血清中CGRP、SP的表达，减轻大鼠偏头痛，可能是通过减少三叉神经末梢对CGRP、SP等神经递质的释放，抑制三叉神经血管系统的激活，预防性治疗偏头痛。