新塔花对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中TLR4/NF-κb信号通路的影响*

张 华 王思静 邢 科 徐亦男 马学宽 倪 昀 王 丽 安冬青

（新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011）

心脑血管病是影响全球病死率最高的疾病，其发病率程升高趋势，目前我国心血管病患者数约2.9亿人次，而动脉粥样硬化（AS）是缺血性心脑血管病的主要病理基础［1］，有多种学说从不同的角度阐述其发病机制。近些年关于AS机制的研究取得了很大的进步，这对于防治AS进一步改善患者的生活质量具有很大的意义。AS在不同的病理生理过程始终伴随着炎症反应。研究表明，组织受损能够诱导免疫反应从而激活Toll样受体 4（TLR4），介导下游因子，激活核因子-κb（NF-κb），启动一系列的炎性因子转录，从而引起炎症反应，导致血管损伤，导致 AS的发生［2-5］。

新塔花（Ziziphora clinopodioidesLam.），又名唇香草，主要分布在我国新疆，中亚及中东等部分地区。此药具有安神、舒张血管、降血压、抗炎止痛等功效，主要用于治疗失眠、高血压病、冠心病等疾病［6-8］。目前关于新塔花水提物治疗AS的研究尚未报道，本实验首次从其抗炎方面防治AS进行研究，以期为其进一步开发利用提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只健康8周龄雄性，体质量（20±2）g，载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠，同品系C57普通小鼠，购于北京维通利华公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养于新疆医科大学第一附属医院科技楼动物房，伦审编号：20171129-02。

1.2 试药与仪器 新塔花全草，购于新疆医科大学附属中医医院（鉴定人：张选明，石河子大学第一附属医院中医科，副主任医师）。阿托伐他汀（批号20151223，1 g/瓶，北京Solarbio公司）、HE染色试剂盒 （北京Solarbio公司）；ICAM、MMP-9 ELISA试剂盒 （上海酶联生物技术有限公司）；GAPDH、TLR4、p-NF-κbp65蛋白购于Elabscience生物公司；PBS缓冲液粉末（pH7.3，北京中杉金桥生物技术有限公司）；柠檬酸盐修复液粉末 （PH6.0，北京中杉金桥生物技术有限公司）；DAB 显色液（invitrogen 公司，美国）；二抗（Anti-Rabbit，invitrogen公司，美国）。EG1150组织包埋机（SAKURA，日本）；RM2235 石蜡切片机（Leica公司，德国）；5424R 低温高速离心机（Eppendrof，德国）；光学显微镜（LEICA DM 2500，德国）；Type1500 多功能酶标仪（Thermo 公司，美国）等。

1.3 分组方法 将40只8周龄ApoE（-/-）小鼠适应性饲养 1周后，随机分为模型组（MX）、他汀组（TT）、新塔花水提物高剂量组 （XG）、新塔花水提物低剂量组（XD），每 10只；同品系 C57小鼠 10只为空白组（KB）；高脂饲料室温饲养。第 2 周开始，TT 组［3 mg/（kg·d）］，XG 组［3.6 g/（kg·d）］，XD 组［0.9 g/（kg·d）］3 组开始药物灌胃干预，MX组和KB组灌胃等量蒸馏水。

1.4 新塔花水提物的制备 取干燥芳香新塔花全草24 g，粉碎后置于圆底烧瓶中，加入200 mL蒸馏水，加热回流2 h后洗涤滤渣，水提率75%，置于旋蒸烧瓶内真空加热1 h，得水提物80 mL左右，定容至100 mL即为所需新塔花高剂量（含生药0.18 g/mL），稀释2倍为低剂量（含生药0.045 g/mL）。

1.5 给药方法 小鼠实验用药量换算公式为：［g/（kg·d）］=9.1×成人临床常药量 ［g/（kg·d）］， 每次灌胃 0.5 mL（0.1～0.3 mL/10 g）/d，每周按照体质量调整给药浓度。MX组和KB组给予0.5 mL蒸馏水灌胃。所有小鼠自由活动，不限饮食饮水。高脂饲料配方：基础饲料82.68%，猪油10%，猪胆盐0.2%，胆固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆医科大学动物中心加工。

1.6 标本采集与检测 所有小鼠灌胃12周末禁食不禁水12 h后，处死小鼠进行以下操作：1）眼球取血后，3 500 r/min离心15 min，取上清置于Ep管内用于ELISA和血脂检测；2）打开胸腹腔，无菌条件下取出小鼠胸主动脉置于4%多聚甲醛固定用于HE染色，升主动脉和主动脉弓置于4%多聚甲醛固定用于免疫组化。胸主动脉与升主动脉甲醛固定48小时，依次经脱水、透明、浸蜡、包埋后，进行切片，每个组织连续切片4 μm厚度5张；按照试剂盒操作，HE染色，依次经过观察小鼠主动脉形态学变化并拍照；ELISA法依次经加样、温育、配液洗涤、拍干、加酶、显色、终止等步骤。用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度（OD）值，以浓度值为横坐标（X），各标准OD值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，利用标准曲线计算出小鼠血清中ICAM-1和 MMP-9浓度值。IHC法检测 TLR4、NF-κbp65蛋白阳性面积表达，经烤片、脱蜡、修复、抗体孵育、过夜、显色、复染、封片等步骤，在光镜下观察主动脉形态学变化并拍照，运用进行Image J软件进行阳性面积分析。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较采用配对t检验。P＜0.05或P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠血脂水平比较 见表1。与KB组比较，MX 组三酰甘油（TAG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）明显升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低（P＜0.01）；与 MX 组比较，TT 组、XG组、XD组 TAG及TC降低明显 （P＜0.01），TT组HDL-C 和 LDL-C 略升高 （P＞0.05），XG 组、XD 组HDL-C升高明显 （P＜0.01），XG组、XD组 LDL-C均降低（P＜0.01）；与TT组比较，XG组各指标具有明显的差异（P＜0.01）。

表1 各组小鼠血脂水平比较（mmol/L，x±s）

表1 各组小鼠血脂水平比较（mmol/L，x±s）

与 KB组比较，*P＜0.01；与 MX 组比较，△P＜0.01；与 TT组比较，#P＜0.01。 下同

组 别 n KB组 6 MX组 6 TT组 6 LDL-C 0.36±0.06 5.84±0.94*6.04±0.19 XG 组 6 0.85±0.15△# 9.81±0.08△#0.99±0.07△#3.86±0.33△#XD 组 6 1.06±0.18△ 10.07±0.96△ 0.9±0.15△ 4.3±0.37△TAG TC HDL-C 0.64±0.01 2.75±0.04 2.17±0.1 1.34±0.07* 15.32±1.01* 0.62±0.01*0.97±0.08△ 13.53±2.86△ 0.63±0.08

2.2 各组小鼠胸主动脉病理形态学变化 胸主动脉HE染色中，KB组管壁几乎无脂质沉积，管腔无明显狭窄。MX组血管壁明显增厚，出现大量的脂质沉积和炎症细胞浸润，管腔狭窄明显；XG组动脉粥样斑块面积明显小于MX组，大于KB组；XD组血管壁增厚，内部脂质沉淀和斑块略低于MX组，管腔有狭窄。TT他汀组管腔狭窄不明显，斑块面积小于MX组，血管损伤小，脂质沉积较少。见图1。

图1 小鼠胸主动脉病理形态学变化（HE染色，200倍）

2.3 各组小鼠血清中ICAM-1和MMP-9表达水平比较 见表2。与KB组比较，MX组ICAM-1和MMP-9水平升高（P＜0.01）；与 MX 组比较，TT 组、XG 组、XD组ICAM-1和MMP-9水平均明显低于MX组 （P＜0.01）；XG组与TT组比较，ICAM-1水平差异无统计学意义（P＞0.05），MMP-9水平差异明显有统计学意义（P＜0.01）。

表2 各组小鼠血清ICAM-1和MMP-9表达水平比较（x±s）

表2 各组小鼠血清ICAM-1和MMP-9表达水平比较（x±s）

组 别 n KB组 6 MX组 6 TT组 6 ICAM-1 MMP-9 435.35±9.73 63.31±0.54 581.54±15.26* 87.65±1.55*423.90±2.47△ 70.01±1.57△XG 组 6 416.57±22.06△ 56.06±1.42△#XD 组 6 475.87±3.18△ 70.85±0.07△

2.3 各组小鼠升主动脉中TLR4、NF-κb免疫组化结果比较 见表3。研究结果表明，与KB组比较，模型组中TLR4和NF-κb积分光密度值上升（P＜0.01）；与MX组比较，TT组、XG组TLR4积分光密度值均下降（P＜0.01），XD 组无明显差异（P＞0.05）；与 MX 组比较，TT组、XG 组、XD 组 NF-κb积分光密度值均下降（P＜0.01）。与TT组比较，XG组TLR4积分光密度值无差异（P＞0.05），XG 组 NF-κb积分光密度值较低（P＜0.05）。

表3 各组小鼠升主动脉组织中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比较（x±s）

表3 各组小鼠升主动脉组织中TLR4和NF-κb的平均光密度定量分析比较（x±s）

组 别 n KB组 6 MX组 6 TT组 6 TLR4 NF-κb 7.36±0.40 4.67±0.24 13.74±1.31* 9.53±0.78*9.77±0.80△ 7.79±0.25△XG 组 6 9.81±0.51△ 6.49±0.33△#XD 组 6 13.31±1.15*△ 7.76±0.51△

3 讨 论

新塔花全草中的化学成分主要为挥发油和非挥发油（总黄酮等）两部分。新塔花挥发油为透明淡黄色油状液体，约占全草的2%［9］。国外有学者采用GC和GC-MS法对伊朗地区新塔花进行化学分析，得出新塔花挥发油中发现27种成分，主要的化合物包括胡薄荷酮（44.5%）等［10］。大量研究表明新塔花具有抗心肌缺血、抗炎杀菌、舒张血管、抗氧化等作用，近些年受到广泛的关注和研究［11-17］。

本研究观察新塔花对动脉粥样硬化模型小鼠TLR4/NF-κb信号通路的影响，结果显示，各药物干预组TLR4、NF-κb的表达水平明显低于模型对照组，表明新塔花可能通过降低TLR4/NF-κb信号通路内的蛋白表达水平，降低细胞间黏附因子、基质金属蛋白酶产生，最终抑制炎症反应，起到防治AS的效果。研究结果还显示新塔花高剂量组比低剂量组药效明显，说明该药具有一定的剂量依赖性。

该实验对新塔花的研究为进一步拓展新塔花资源，发挥中医药多靶点、多层面和个体化的优势，尤其是应用于防治以AS为基础的心脑血管疾病，具有重要指导意义，为新塔花在心血管病研究中提供了科学依据和理论基础。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，有待深入的研究。如果并不是所有生物碱都能以抑制信号通路、抗炎为靶向防治心脑血管疾病，笔者推断新塔花挥发油可能会是抗炎的主要成分，其药效学和机制有待进一步研究。