苏木乙酸乙酯提取液靶向调控miRNA-99a抑制动脉粥样硬化的作用机制研究*

于 玲 曹丽娟 孙 静 周亚滨△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

心源性死亡仍然是目前世界范围内导致死亡的主要原因，据调查数据显示，每年有超过1 700万人死于心血管疾病［1］。作为心源性死亡的独立预测因素之一，冠状动脉粥样硬化斑块病变是导致管腔狭窄、闭塞的主要原因，能够引发心肌缺血或心肌坏死，增加冠状动脉不良事件的风险［2］。因此，减少动脉粥样硬化斑块病变是改善患者预后的主要途径之一。

作为血管壁最丰富的固有细胞，血管平滑肌细胞（VSMC）在维持血管张力和血管壁结构的构成中扮演着重要的角色。既往研究证实，VSMC的过度增殖是造成动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和肺动脉高压的病理学基础，故调控VSMC的增殖和凋亡，是预防冠状动脉病变的关键［3］。我们前期研究发现，苏木乙酸乙酯提取液（SAEE）不仅能够抑制炎性因子的分泌，还能够改善动脉粥样硬化大鼠腹主动脉的组织形态和内皮细胞功能，并且抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白的表达，从而起到抗动脉粥样硬化的作用［4］。因此本研究以细胞中miRNA-99a的表达为媒介，并通过观察VSMC的增殖和凋亡水平，进一步探索SAEE的抗动脉硬化作用机制和作用靶点。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系 大鼠主动脉VSMC购于湖南丰晖生物科技有限公司，细胞常规培养于DMEM培养基中，培养条件：37℃，5%CO2。每3日换1次培养液，并以0.25%的胰酶消化传代，取3～6代细胞用于实验。

1.2 试剂与仪器 苏木生药购于黑龙江中医药大学附属第一医院，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取后得SAEE（生药质量浓度设置为200 μg/mL）；氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）购于广州奕元生物科技有限公司；胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清均购于美国Thermo Fisher公司；青霉素-链霉素溶液购于上海酶联生物研究所；Hilymax转染试剂盒购于上海东仁化学科技有限公司；MTT细胞增殖试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗大鼠Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、MMP-1、TIMP-1、β-actin 单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗购于北京博尔迈生物技术有限公司。

1.3 细胞转染与分组 miRNA-99a模拟剂（mimics）和抑制剂（inhibitor）由上海拓然生物科技公司设计并化学合成，按照试剂盒设定的转染浓度，分别将miRNA-99a mimics和miRNA-99a inhibitor配制成终浓度为80 nmol/L和50 nmol/L的溶液。分别加入3 μL Hilymax转染试剂，混匀，冰上静置20 min。取对数生长期细胞，按照1×105/mL的密度接种于6孔板中，每孔2 mL。当细胞长至80%融合时，更换为无胎牛血清的无抗生素DMEM培养液。将细胞分为5组，空白组（20%无血清无抗生素DMEM），模型组（50 μg/mL ox-LDL），SAEE 组（200 μg/mL SAEE），miRNA-99a mimics组（80 nmol/L miRNA-99a micmics）和 miRNA-99a inhibitor组（50 nmol/L miRNA-99a inhibitor）。

1.4 检测指标 1）MTT法检测细胞增殖：取不同处理方法干预后VSMC细胞以1×104/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，实验平行设置24、48、72、96 h 4个时间点。每孔加入 20 μL MTT（5 mg/mL）后继续孵育 1 h，采用酶标仪测定各孔570 nm处吸光度（OD值）。2）流式细胞检测细胞凋亡：将不同处理方法干预后24 h的VSMC细胞接种于96孔板中，用1×Binding buffer配制成1×106个/mL的细胞悬液。分别加入5 μL Annexin V和10 μL的PI溶液染色15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。3）Western blotting检测细胞中蛋白的表达：各组细胞经处理48 h后，用PBS冲洗2次，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白转移至0.22 μm PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液洗涤5次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h。化学发光试剂显影后，凝胶图像分析系统采集图片并分析各蛋白条带灰度值。4）RT-PCR检测miRNA-99a的表达：各组细胞经处理48 h后，Trizol一步法提取总RNA，经纯化、定量后逆转录合成cDNA，采用SYBR Green I real-time PCR检测mRNA的相对表达量。引物设计如下（上海生工公司合成）：miRNA-99a上游5′-CATTACTAAACCCGTAGATCCGAT-3′；下游 5′-TAT GGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′；U6 上 游 5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3′；下游 5′-GGAACGC TTCACGAATTTG-3′。PCR循环条件为 95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。以U6作为内参，并采用2-△△CT法分析miRNA-99a的相对表达量。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。各组数据以（±s）表示，符合正态分布及方差齐性检验，则组间比较采用ANOVA分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组VSMC细胞增殖情况的比较 见表1。ox-LDL刺激后的VSMC细胞增殖能力显著增加，4个时间段与空白组比较，差异均具有显著统计学意义（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor组中VSMC细胞增殖能力显著增加，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.01），而SAEE组与miRNA-99a mimics组均能显著抑制VSMC细胞增殖，与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 各组VSMC细胞凋亡率的比较 见表2，图1。模型组中VSMC细胞凋亡率显著增加，其中早期凋亡与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而晚期凋亡和总凋亡率与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；miRNA-99a inhibitor组中晚期凋亡和总凋亡率亦显著增加，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。SAEE组与miRNA-99a mimics组均能显著抑制VSMC细胞凋亡，其中以晚期凋亡和总凋亡率显著，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），早期凋亡与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组VSMC细胞增殖情况的比较（吸光度值，x±s）

表1 各组VSMC细胞增殖情况的比较（吸光度值，x±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

组 别 n空白组 6模型组 6 SAEE组 6 24 h 48 h 72 h 96 h 0.34±0.11 0.68±0.12 1.08±0.23 1.43±0.18 0.51±0.06△△ 1.07±0.13△△ 1.52±0.23△△ 2.02±1.10△△0.37±0.03**0.72±0.10**1.08±0.18** 1.45±0.23**miRNA-99a mimics组 6 0.40±0.03**0.79±0.11**1.14±0.13**1.52±0.17**miRNA-99a inhibitor组 6 0.64±0.06**1.32±0.23**1.86±0.15**2.44±0.29**

表2 各组VSMC细胞凋亡率的比较（%，x±s）

表2 各组VSMC细胞凋亡率的比较（%，x±s）

组别 n空白组 6模型组 6 SAEE组 6总凋亡率 早凋 晚凋6.64±1.08 1.96±0.03 4.68±1.10 11.66±1.60△△ 1.94±0.08 9.71±1.59△△6.98±1.28**2.04±0.12 4.94±1.18**miRNA-99a mimics组 6 8.72±1.01**2.04±0.09 6.68±1.02**miRNA-99a inhibitor组 6 14.03±1.42**1.86±0.09 12.17±1.40**

图1 各组VSMC细胞的流式凋亡结果

2.3 各组VSMC细胞中 Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达的比较 见表3，图2。模型组中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表达及Bax/Bcl-2的比值显著增加，Bcl-2蛋白的表达显著降低，与空白组比较，差异均有统计学意义 （P＜0.01）；SAEE 组与 miRNA-99a mimics组中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表达及Bax/Bcl-2的比值显著降低，Bcl-2蛋白的表达显著增加，与空白组比较，差异均有统计学意义 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor组中Ki-67、PCNA、Bax蛋白的表达及Bax/Bcl-2的比值显著增加，Bcl-2蛋白的表达显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表3 各组VSMC细胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（x±s）

表3 各组VSMC细胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（x±s）

组 别 n空白组 6模型组 6 SAEE组 6 Bcl-2 β-actinBax/Bcl-2 1.23±0.24 0.18±0.03 0.55±0.11△△ 1.69±0.43△△1.03±0.19**0.33±0.07**miRNA-99a mimics组 6 0.77±0.11** 0.76±0.25** 0.44±0.05** 0.89±0.11**0.50±0.09**miRNA-99a inhibitor组 6 1.50±0.23** 2.01±0.40** 1.21±0.26** 0.30±0.04**4.05±0.89**Ki-67 β-actin PCNA β-actin Bax β-actin 0.30±0.09 0.37±0.10 0.22±0.03 1.12±0.27△△ 1.41±0.28△△ 0.90±0.15△△0.58±0.14** 0.62±0.15** 0.34±0.04**

图2 各组VSMC细胞中Survivin、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达的比较

2.4 各组VSMC细胞中MMP-1、TIMP-1蛋白表达的比较 见表4。模型组中MMP-1蛋白的表达及MMP-1/TIMP-1的比值显著增加，TIMP-1蛋白的表达显著降低，与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；SAEE组与miRNA-99a mimics组中MMP-1蛋白的表达及MMP-1/TIMP-1的比值显著降低，TIMP-1蛋白的表达显著增加，与空白组比较，差异均有统计学意义 （P＜0.01），miRNA-99a inhibitor组中 MMP-1 蛋白的表达及MMP-1/TIMP-1的比值显著增加，TIMP-1蛋白的表达显著降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组VSMC细胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表达的比较（x±s）

表4 各组VSMC细胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表达的比较（x±s）

组 别 n空白组 6模型组 6 SAEE组 6 MMP-1 β-actin TIMP-1 β-actin MMP-1/TIMP-1 0.39±0.06 1.01±0.18 0.39±0.05 1.24±0.22△△ 0.49±0.14△△ 2.76±1.05△△0.62±0.12** 1.14±0.27** 0.59±0.23**miRNA-99a mimics组 6 0.70±0.23** 0.85±0.09** 0.83±0.28**miRNA-99a inhibitor组 6 1.53±0.22** 0.22±0.03** 7.25±1.27**

图3 各组VSMC细胞中MMP-2、TIMP-2蛋白表达的比较

2.5 各组VSMC细胞中miRNA-99a表达的比较 见表5。与空白组比较，模型组中miRNA-99a的表达显著降低（P＜0.01）；SAEE能够显著增加VSMC细胞中miRNA-99a的表达，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），与 miRNA-99a mimics作用相同，与miRNA-99a inhibitor作用相反。

表5 各组VSMC细胞中miRNA-99a表达的比较（x±s）

表5 各组VSMC细胞中miRNA-99a表达的比较（x±s）

组 别 n空白组 6模型组 6 SAEE组 6 miRNA-99a的相对表达量1.03±0.08 0.57±0.11△△3.09±0.15**miRNA-99a mimics组 6 3.58±0.40**miRNA-99a inhibitor组 6 0.24±0.04**

3 讨 论

脉粥样硬化形成的初期，低密度脂蛋白汇集于斑块的中央部位，其内的不饱和脂肪酸在自由基和其他致氧因素作用下，经过一系列的氧化和修饰过程，最后形成 ox-LDL［5］。 ox-LDL 能够通过刺激 VSMC、内皮细胞和巨噬细胞释放多种趋化因子和炎性因子，是促进斑块的形成和失稳的关键［6］。本研究采用ox-LDL刺激的方式复制VSMC模型，能够更加可靠地反映动脉粥样硬化形成及失稳过程中的病理变化。

VSMC的增殖能够引起内膜增厚和斑块形成，是管腔狭窄和动脉粥样硬化的病理学基础。Ki-67与细胞的有丝分裂过程密切相关，是目前公认的检测细胞增殖活性的重要标志物［7］。作为DNA复制过程和细胞增殖的关键标志物之一，PCNA是一种分子量为36KD的DNA聚合酶δ的辅助蛋白，主要存在于细胞核内，在调控细胞周期、DNA损伤修复和甲基化的过程中发挥着重要的作用［8］。虽然VSMC的凋亡能在一定程度上抗衡增殖引起的斑块形成，但是近年来大量的研究发现，细胞凋亡亦与动脉粥样硬化的生成和稳定性密切相关［9］。 VSMC 的凋亡能够导致 IL-8、IL-1α 等细胞因子的释放，促进巨噬细胞的浸润和加重斑块内的炎症反应，令斑块失稳；同时，晚期凋亡的VSMC能够增加凝血酶的合成和局部凝血酶的活性，促进血栓形成［10］。Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的主要成分，其能够阻止线粒体细胞色素C释放发挥抗凋亡的作用［11］。Bax作为Bcl-2家族的前凋亡蛋白，能够促进线粒体释放细胞色素C和促进内质网中钙离子的释放，拮抗Bcl-2的抗凋亡作用进而促进细胞凋亡［12］。

细胞外基质（ECM）是构成动脉粥样硬化斑块纤维帽的主要成分之一［13］。ECM的合成、降解和成分的稳定，取决于MMP和基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）之间的动态平衡。在生理状态下MMP-1处于低浓度水平，而在炎症因子的刺激下MMP-1的分泌持续增加，TIMP-1能够结合MMP-1形成非共价的复合物，限制其降解胶原的作用［14］。在本研究中我们发现，SAEE能显著抑制VSMC细胞增殖和晚期凋亡，降低细胞中Ki-67、PCNA、Bax、MMP-1 蛋白的表达及 Bax/Bcl-2、MMP-1/TIMP-1的比值，增加Bcl-2和TIMP-1蛋白的表达，说明SAEE具有促进斑块的稳定和防止斑块的脱落或破裂的作用，其作用机制是通过调控VSMC细胞增殖、凋亡和细胞外基质的合成、降解实现的。

近年来大量的的研究表明，MicroRNA在动脉硬化的发生与发展过程中，发挥着重要的作用［15］。其中miRNA-99a能够通过抑制IGF-1R and mTOR信号通路的活化，从而抑制VSMC的增殖，延缓动脉硬化的发生与发展［16］。本研究结果显示，SAEE能够显著增加VSMC细胞中miRNA-99a的表达，与miRNA-99a mimics组结果相同，与miRNA-99a inhibitor结果相反，因此我们推断SAEE调控VSMC细胞增殖、凋亡和ECM的合成、降解的作用，可能是通过上调细胞中miRNA-99a的表达实现的。

综上所述，SAEE能够抑制VSMC细胞增殖、凋亡和细胞外基质的降解，促进斑块的稳定和防止纤维帽的破裂，其作用机制是通过上调细胞中miRNA-99a的表达实现的。