牦牛不同组织SREBP-1基因表达差异分析

袁锦莹, 孙万成, 罗毅皓， 谢凤莲

(青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

青海特殊的高原气候赋予了牦牛乳高于普通牛乳的营养价值。牦牛乳的脂肪和蛋白质的含量较普通牛乳高。牦牛乳的乳脂率平均达7.5%，高于普通牛乳，蛋白质含量平均达5.2%，也高于普通牛乳，且干物质总量也高于普通牛乳[1]。牦牛乳是一种高脂高蛋白的天然浓缩乳，是乳制品加工和制作的优良原料乳[2-4]。

青海牦牛是生长在青藏高原地区的一种稀有牛种，这里海拔高，气候寒冷，因此造就了牦牛不同于普通牛种的独特体质，牦牛肉脂肪含量不高，并含有大量的营养成分和丰富的微量元素，特别是含有人体必需的脂肪酸，对人体的健康是非常重要的[5-8]。加之它们常年以这一地区的天然牧草为食，所产的牦牛奶具有独特的营养[9]。

在脂肪组织中，脂肪生成相关基因的表达水平受到许多转录因子的调控[10]。有研究指出，甾醇类调控元件结合蛋白(SREBP)是一种核转录因子，在酯类合成中，尤其是在固醇类和脂肪酸合成中起到重要作用[11]。SREBP是物体内脂肪合成的一个极重要的调节因子，通过调节动物体内与脂肪生成相关的酶(生脂酶)的基因转录水平而调节这些酶的活性，从而控制体内脂肪合成。

已有研究证明，SREBP-1是哺乳动物肝脏脂肪生成基因的主要调节者，能调节脂肪酸、甘油三酯和胆固醇合成的30多个基因的表达[12]。也有研究证实，SREBP-1是脂肪酸合成相关酶基因的上游调节元件[13]。金世杰等[14]研究者在对黄牛中SCD1与SREBP-1的协同表达研究后发现，SREBP-1可激活SCD1脂肪酸合成酶，导致脂肪酸合成增加，造成肝脏脂质蓄积。

青海是全国五大牧区之一，是牦牛的主要产区，目前全省有牦牛约500万头。牦牛是青海的特色，具有其独特的营养价值。而关于改善青海牦牛肉品质的研究鲜有报道，为此，本研究采集青海省不同地区不同季节的牦牛结肠、肾脏和肝脏3种组织的样品，提取Total RNA，在逆转录聚合酶的作用下生成cDNA,以逆转录产物为模板，利用Real-time PCR检测牦牛甾醇类调控元件结合蛋白1(SREBP-1)基因mRNA的表达水平，旨在为进一步改善牛肉品质提供可借鉴的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集不同季节不同地区的牦牛肝脏、肾脏和结肠，于冻存管中投入液氮罐保存备用；RNAprep Pure Tissue Kit试剂盒，购自天根生物科技(北京)有限公司；TaKaRa PrimeScript ® RT reagent Kit试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；SYBR ®Premix Ex TaqTMⅡ，购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 仪器与设备

低温离心机(上海沪粤明科学仪器有限公司)；AlphaTM Unit Block Assembly for DNA Engine ® System (BIO-RAD)；电泳仪BG-Power 300(BAYGENE BIOTECH COMPANY LIMITED)；凝胶成像分析仪WD-9413A(北京市六一仪器厂)；iQTM 5 Multicolor Real-time PCR Detection system(BIO-RAD)。

1.3 方 法

1.3.1 引物设计 引物(表1)是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.2 牦牛肝脏、肾脏及总RNA的提取 使用RNAprep Pure Tissue Kit试剂盒分别从新鲜或超低温冻存的肝脏样品中提取总RNA，最后进行RNA纯度与浓度检测，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1.3.3 RNA凝胶电泳 根据样品量选择合适大小的凝胶，表2中的配方可按相应比例扩大[15]。

表2 电泳胶配方

1.3.4 不同季节牦牛肝脏、肾脏及结肠cDNA的合成 cDNA的合成以从2015年春季祁连县、2015年秋季大通县、2016年春季湟中县采集的牦牛肝脏、肾脏和结肠中提取的Total RNA为模板，按试剂盒推荐方法进行操作。

1.3.5 不同季节牦牛不同组织的实时定量PCR 以合成的cDNA为模板，按试剂盒推荐方法进行操作。

1.3.6 荧光定量PCR 按试剂盒推荐方法进行操作，按表3中的组分配制反应液(反应液配制在冰上进行)，荧光定量时，β-actin作为内参进行实时定量PCR。

表3 荧光定量反应液

1.3.7 统计方法 利用SPSS 16.0软件分析统计组的差异性，采用最小显著差数法，计量数据用平均值±标准差，采用t检验，P<0.05表示脂肪酸差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 提取的RNA检测

从RNA电泳图(图1)可以看出，上方的28S和下方18S条带都很清晰，且28S约为18S条带亮度的2倍，说明提取的RNA完整性良好。

图1 不同样品RNA电泳图

2.2 牦牛肝脏、肾脏及结肠SREBP-1基因cDNA的合成

图2为由3个组织中提取的RNA反转录后扩增的结果图。利用在编码区两侧设计的牦牛SREBP-1引物扩增cDNA，获得约150 bp的DNA片段。

图2 样品SREBP-1引物扩增结果

2.3 SREBP-1基因PCR荧光定量

由图3可以看出，SREBP-1基因在2015年春季祁连县、2015年秋季大通县和2016年春季湟中县的荧光定量结果，溶解曲线只有1个峰，说明其两对引物的特异性强，没有引物二聚体和非特异性产物，所以进行荧光定量可以真实地反映出牦牛不同组织中引物mRNA的表达。

采用相对定量[16]，通过比较阈值法(2-ΔΔCt)进行相对定量[17]。

Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数[18]。由表4、表5和表6可以看出，Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

图3 SREBP-1的溶解曲线分析

样品牦牛SREBP引物反应Ct值内参β-actin反应Ct值第1次第2次第3次平均值第1次第2次第3次平均值ΔCtΔCt平均值肾脏127.07 28.31 27.11 27.50±0.57519.7121.24 23.52 21.49±1.9196.01 肾脏227.53 27.50 27.62 27.55±0.06221.4320.66 20.10 20.73±0.6696.82 6.34肾脏328.37 28.10 28.10 28.19±0.15621.9421.17 22.89 22.00±0.7606.19 结肠128.54 26.86 26.37 27.26±1.06518.2718.41 18.40 18.36±0.0788.90 结肠229.15 29.34 29.04 29.18±0.14721.6421.18 21.11 21.31±0.2897.87 8.13结肠328.95 27.62 27.76 28.11±0.92520.5820.24 20.66 20.49±0.3177.62 肝脏126.19 26.48 25.28 25.98±0.75625.2924.42 23.42 24.38±0.9371.60 肝脏226.24 25.90 25.53 25.89±0.35320.7821.50 23.77 22.01±1.5643.88 1.90肝脏321.53 21.55 21.45 21.51±0.05321.5921.16 21.12 21.29±0.2600.22

表5 2015年秋季大通县SREBP-1基因荧光定量

表6 2016年春季湟中县SREBP-1基因荧光定量

将肝脏样品作为对照样品，将对照组的2-ΔΔCt值设为1进行阈值比较。

根据公式：

2-ΔΔCt=

2-[(实验组SREBPCt-实验组β-ACTIN Ct)-(对照组SREBPCt-对照组β-ACTIN Ct)]

(1)

由公式(1)计算得，

表4，2015年春季：

肾脏，2-(6.34-1.90)=0.046

结肠，2-(8.13-1.90)=0.013

表5，2015年秋季：

肾脏，2-(6.93-4.70)=0.213

结肠，2-(6.72-4.70)=0.247

表6，2016年春季：

肾脏，2-(6.16-6.21)=1.035

结肠，2-(8.45-6.21)=0.212

由上述结果可以得出,SREBP-1 mRNA相对定量的拷贝数。

通过对SREBP-1的DNA重复3次进行荧光定量PCR检测法，测出它们的平均ΔCt值，再根据比较阈值法进行相对定量的结果。

由图4可以看出，不同季节中除了2016年春季湟中县的牦牛，其他的均以肝脏样品中的SREBP-1 mRNA相对定量拷贝数最高。2015年春季祁连县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为：肝脏、肾脏、结肠；2015年秋季大通县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为：肝脏、结肠、肾脏；2016年春季湟中县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为：肾脏、肝脏、结肠。

图4 不同季节SREBP-1基因在牦牛不同组织中相对表达量

2.4 不同季节SREBP-1基因相对表达量相关性分析

从表7中可以看出，SREBP-1基因在2015年春季祁连县和2016春季湟中县中相对表达量差异极显著，在2015年秋季大通县和2016年春季湟中县中相对表达量差异不显著，并在2015年春季祁连县和2015年秋季大通县中相对表达量差异不显著。

表7 3个季节SREBP-1相对表达量相关性分析

注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。下同。

2.5 SREBP-1基因在牦牛不同组织中的相对表达量

由图5可以看出，牦牛不同组织中SREBP-1基因相对表达量由大到小顺序为，肝脏、肾脏、结肠。

图5 SREBP-1基因在牦牛不同组织中的相对表达量

2.6 3个组织SREBP-1基因相对表达量相关性分析

从表8中可以看出，SREBP-1基因在结肠和肝脏中相对表达量差异极显著，在肾脏和肝脏中相对达量差异显著，而在结肠和肾脏中相对表达量差异则不显著。

SREBP-1的作用主要包括调控脂肪细胞的分化，以及类固醇和脂肪酸的合成过程。SREBP-1基因可以直接调节脂肪沉积，还可参与脂肪生成相关基因的表达水平的调控，间接调节脂肪的生成。目前对SREBP-1基因的研究也主要集中在猪、鸡、兔上。例如，2001年，Gondret等使用Northern印迹法对SREBP-1 mRNA猪、鸡、兔的组织中的表达量进行检测分析，预测SREBP-1基因在肝脏和脂肪这两种组织间相对表达量的高低[19]。

SREBP-1mRNA在兔的肝脏以及脂肪组织中从表达水平上看几乎保持在一个水平，在鸡的脂肪组织中SREBP-1 mRNA 的表达水平比在肝脏中低了近乎3倍左右[20]。除此之外，SREBP-1信号转导途径在脂肪代谢性疾病研究中起着重要的作用[21]。本研究检测SREBP-1基因在牛的组织中的相对表达量，发现SREBP-1 基因在青海牦牛的3个组织中均有表达，但在2015年春季祁连的牦牛结肠和肾脏中的表达均不高，其中，SREBP-1基因在2016年春季湟中的牦牛肾脏中表达最高。预测不同生长环境和不同季节也会对SREBP-1基因的表达产生一定的影响。

表8 3个组织SREBP-1相对表达量相关性分析

3 结 论

青海牦牛不同组织中SREBP-1基因相对表达量为：肝脏>肾脏>结肠。3个组织中SREBP-1基因在结肠和肝脏中相对表达量差异极显著，在肾脏和肝脏中相对表达量差异显著，而在结肠和肾脏中相对表达量差异则不显著。不同季节中除了2016年春季湟中县的牦牛，其他的均以肝脏样品中的SREBP-1 mRNA相对定量拷贝数最高。2015年春季祁连县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为，肝脏、肾脏、结肠；2015年秋季大通县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为，肝脏、结肠、肾脏；2016年春季湟中县牦牛SREBP-1基因相对表达量由大到小为，肾脏、肝脏、结肠。

不同季节间SREBP-1基因在2015春季祁连县和2016春季湟中县中相对表达量差异极显著，在2015年秋季大通县和2016春季湟中，2015春季祁连县和2015秋季大通县中相对表达量差异则不显著。