元宝枫叶中单宁的含量测定

2019-04-28李知陆康欣李哲贾有青陈文庆单秀峰肖志刚

食品研究与开发 2019年9期

李知陆，康欣，李哲，贾有青，陈文庆，单秀峰，肖志刚

（沈阳师范大学，辽宁沈阳110034）

元宝枫[1]在生长期的叶和种子富集了较多脂肪酸、蛋白质和单宁[2]。单宁是一种水溶性的酚类化合物，是食品中常见的化学物质，具有一定的抗氧化性和抑制蛋白酶活力及清除自由基的作用[3-6]。辽宁是元宝枫的主要产区，因其种子的形状类似“金元宝”而得名，元宝枫有着悠久的种植记录，本次试验样品采集于辽宁铁岭县营盘村种植基地。试验测试采用的国标参照：GB/T 27985-2011《饲料中单宁的测定分光光度法》。本试验通过钨酸钠-磷钼酸比色法[7]对加热时间、温度和料液比的不同水平的预处理方法进行单因素试验和正交优化试验；进而找到优化的检测条件[8]，提取出更多的单宁，为元宝枫副产品的研发提供依据[9-12]。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

752N 型紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SB25-12DTDN 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ESJ120-48 型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；GFL-125 电热鼓风干燥箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.1.2 试剂

元宝枫叶：辽宁铁岭营盘子村元宝枫基地；钨酸钠（分析纯）、钼酸钠（分析纯）、磷酸（分析纯）、盐酸（分析纯）、硫酸锂（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、没食子酸（基准试剂）：上海同田生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

将500 g 元宝枫叶放置于60 ℃烘箱中烘至恒重。干燥避光密封保存，备用。

1.2.2 试剂配制

钨酸钠-钼酸钠混合溶液：称取50.0 g 钨酸钠，12.5 g 钼酸钠，用350 mL 水溶解到1 000 mL 回流瓶中，加入25 mL 磷酸及50 mL 盐酸，充分混匀，小火加热回流1.5 h，再加入75 g 硫酸锂，25 mL 蒸馏水，冷却，转入500 mL 容量瓶定容，过滤，置棕色瓶中保存，使用时稀释1 倍。原液在室温下可保存半年。

75 g/L 碳酸钠溶液：称取37.5 g 无水碳酸钠溶于250 mL 温水中，混匀，冷却，稀释至500 mL，过滤到储备瓶中备用。

没食子酸标准储备液：准确称取0.110 0 g 没食子酸溶解并定容至100 mL，此溶液的质量浓度为1 000 mg/L。在冰箱2 ℃～3 ℃下可保存5 d。

没食子酸标准使用液：分别吸取1 000 mg/L 没食子酸标准储备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL容量瓶中，定容，溶液质量浓度分别为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

1.2.3 单宁标准曲线的绘制

吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L 没食子酸标准使用液各1.0 mL，分别加5.0 mL 水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，混匀，没食子酸标准溶液浓度分别为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度[13-16]。

1.2.4 单宁测定的工作流程

元宝枫枫叶选样→烘干→称重→水提→超声→取液→测量

1.2.5 单宁含量测定的单因素试验

通过控制试验的水浴温度、加热时间、样品稀释倍数3 个因素来测定元宝枫叶中单宁的含量。

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），加入350 mL 水[17]，在超声装置中加热40 min，水浴温度分别为50、60、70 ℃，上述操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL 水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度[18]，以吸光度代表元宝枫枫叶中单宁含量作图。

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），加入350 mL 水，在超声装置中加热时间分别为20、40、60 min，水温为60 ℃，上述操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL 水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度，以吸光度代表元宝枫枫叶中单宁含量作图。

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），在超声装置中加热时间为40 min，水温为60 ℃，分别将样品与水按1∶90、1∶120、1∶150（g/mL），上述操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度，以吸光度代表元宝枫枫叶中单宁含量作图。

1.2.6 元宝枫枫叶中单宁含量测定的正交试验

根据单因素试验结果，选用三因素三水平的正交试验，即L9（33），确定最佳因素水平，得出单宁最低含量[19]，因素水平表如表1。

表1 元宝枫叶中单宁的因素水平表Table 1 The factors of tannin in Acer truncatum Bunge leaves

1.2.7 样品中单宁含量的计算方法

式中：ω 为试样中单宁含量，mg/L；ρ 为试样测定液中没食子酸的浓度，mg/L；10 为试样测定液定容体积，L；A 为样品稀释倍数；m 为试样体积，L。

2 结果与分析

2.1 单宁测定的标准曲线

首先测出没食子酸溶液的标准曲线，该标准曲线的相关系数为0.990 3，关系式为y=0.034x+0.028 8。

没食子酸溶液标准曲线见图1。

图1 没食子酸溶液标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid solution

2.2 单因素试验结果

2.2.1 水浴温度对单宁含量测定的影响

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），加入350 mL 水，在超声装置中加热40 min，水浴温度分别为50、60、70 ℃，上述操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL 水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度，以吸光度代表元宝枫叶中单宁含量作图[20]。经过平行试验统计水浴温度对单宁含量的影响结果见图2。

图2 水浴温度对单宁含量的影响Fig.2 Effect of water bath temperature on tannin content

从图2可以看出，水浴温度为50 ℃～60 ℃时，随着水浴温度的增加，元宝枫叶中单宁含量呈上升趋势，60 ℃以后，再随着水浴温度的增加，元宝枫枫叶中单宁含量不再改变，所以水浴温度为60 ℃时提取元宝枫枫叶中单宁含量最多。

2.2.2 加热时间对单宁含量测定的影响

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），加入350 mL 水，在超声装置中加热时间分别为20、40、60 min，水温为60 ℃，操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL 水，1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度，以吸光度代表元宝枫叶中单宁含量作图。经过平行试验统计加热时间对单宁含量的影响见图3。

从图3可以看出，加热时间为20 min～40 min 时，随着加热时间的长，提取元宝枫枫叶中单宁含量呈现逐渐升高趋势，40 min 以后，随着加热时间的继续增长，单宁含量呈现下降趋势，所以加热时间为40 min时提取元宝枫叶中单宁含量最多。

图3 加热时间对单宁含量的影响Fig.3 Effect of heating time on tannin content

2.2.3 样品稀释倍数对单宁含量的影响

称取3.06 g 元宝枫干样枫叶（相当于10 g 元宝枫湿样枫叶），在超声装置中加热时间为40 min，水温为60 ℃，分别加入260、350、435 mL 水，上述操作结束后，分别吸取1 mL 提取液，分别加5.0 mL 水，1.0 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL 碳酸钠溶液，显色，放置2 h，在波长为765 nm 处测定溶液的吸光度，以吸光度代表元宝枫叶中单宁含量作图。经过平行试验统计样品稀释比例对单宁含量的影响见图4。

图4 样品稀释比例对单宁含量的影响Fig.4 Effect of dilution ratio of sample on tannin content

从图4可以看出，样品稀释比例即枫叶与水配比从1∶90（g/mL）到1∶120（g/mL）时，提取元宝枫枫叶中单宁含量升高，枫叶与水配比在1∶120（g/mL）以后，单宁含量就逐渐降低，所以单宁在枫叶与水配比1∶120（g/mL）时，提取元宝枫枫叶中单宁含量是最多的。

2.3 正交试验优化分析

以单因素试验结果为基础，设计三因素三水平正交试验，最终得出单宁检测的较佳条件，试验结果见表2。

通过极差分析可看出，R（C）＞R（B）＞R（A），所以影响元宝枫叶单宁含量的因素主要大小为：样品料液比（C）＞加热时间（B）＞水浴温度（A），即料液比影响最大，水浴温度影响最小，从正交试验中可以得到提取元宝枫叶单宁含量的最佳条件为A3B2C1，即水浴温度为70 ℃，加热时间为40 min，元宝枫叶与水的比例为1∶90（g/mL）。在此条件下进行验证试验，经过测试和计算得到提取元宝枫叶中单宁的含量为338.9 g/kg