液质联用技术在慕萨莱思葡萄酒非挥发性成分检测中的应用

王子坤，韩爱芝，张璐，奚倩，3，黄英，3，李雅雯，马国才，贾清华，李磊，侯旭杰，3，*

（1.塔里木大学分析测试中心，新疆阿拉尔843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；3.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

慕萨莱思始于东汉末年，是西域最古老的葡萄酒，被誉为古老葡萄酒酿制工艺的“活化石”。慕萨莱思是古代西域葡萄酒酿造技术的创新和发展，距今已经有几千年的历史，它是新疆民族特色传统葡萄酒，传承着刀郎文化的精髓与灵魂。它用葡萄汁自然发酵而成，不添加任何防腐剂和香精佐料，这种传统的工艺加入了新疆第一批非物质文化遗产。慕萨莱思葡萄酒在酿造过程中需要将葡萄皮渣加清水熬煮后加入到葡萄汁中混合发酵。从慕萨莱思葡萄酒和现代化生产葡萄酒的制作工艺中不难看出两者的差别，慕萨莱思葡萄酒特有的熬煮葡萄皮过滤后加入到葡萄汁里，使慕萨莱思葡萄酒具有其独有的风味。采用液质联用技术分析慕萨莱思葡萄酒，对其中的非挥发性成分进行分析[1-7]。同时对比自酿葡萄酒、进口葡萄酒、工厂生产慕萨莱思三者的区别，同时对比自酿葡萄酒不同酿造阶段成分、以及含量区别。通过分析慕萨莱思葡萄酒中的成分，可以了解其中是否有有害成分，后期可进一步指导生产[8-10]。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料

葡萄原汁、浓缩汁、慕萨莱思（自酿）均是自酿过程中采集样品，酿酒葡萄原料是和田红葡萄；非自酿成品酒有3 种分别是：葡萄酒（食品系酿）：塔里木大学生命科学学院食品科学系自酿葡萄酒，原料是葡萄、玫瑰花、红枣、枸杞；葡萄酒（进口）：市购；慕萨莱思（阿瓦提）：新疆阿瓦提刀郎慕萨莱思有限公司购买。乙腈（色谱级）：德国默克Merck；甲酸（色谱级）：上海安普科技公司。

1.1.2 仪器

Agilent 6410B 三重四级杆液质联用仪配二极管阵列（DAD）检测器：美国Agilent 公司；GL-20G-2 高速冷冻离心机：上海安亭公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理方法

取准备好的样品20 mL，4 000 r/min 离心10 min。取上清液过0.22 μm 滤膜，备用。

1.2.3 高效液相色谱条件

色谱柱：安捷伦ZORBAX-SB C18（100 mm×2.1 mm i.d.，3.5 μm）；流速：0.3 mL/min；检测波长：280 nm；进样量：5 μL；柱温箱：30 ℃；流动相A：水（0.1%甲酸），流动相B：乙腈（0.1%甲酸）。

1.2.4 质谱条件

扫描模式：负离子和正离子模式；扫描范围：m/z 100～1 500；雾化气：50 psi；离子源温度（TEM）：330 ℃；离子源电压（IS）：+4 500 V 或-4 500 V。

1.2.5 数据处理

数据的处理是参考文献[11-13]分析物质类型和物质的名称，通过光谱图分析物质含量变化。

2 结果与分析

2.1 慕萨莱思酿造过程中物质种类及含量变化

2.1.1 葡萄原汁与浓缩汁

葡萄原汁与浓缩汁色谱图见图1。

图1 葡萄原汁和浓缩葡萄汁在UPLC-UV-280nm下的色谱图Fig.1 Chromatogram of grape juice and concentrated grape juice at uplc-uv-280 nm

分析图1中的色谱峰可以得出，葡萄原汁的物质分析结果按照保留时间排序，2.827 min 处没食子酸、8.360 min 处为咖啡酸、9.560 min 处为原花色素B1、10.107 min 处为酒石酸、10.753 min 处为儿茶素、12.460 min 处为原花色素B2、13.613 min 处为表儿茶素、14.473 min 处为黄诺马苷、17.878 min 处为芦丁、18.513 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷[14-15]。浓缩汁的物质分析结果按照保留时间排序，2.413 min 处为没食子酸[16-17]、8.013 min 处为咖啡酸、9.347 min 处原花色素B1、9.893 min 处为酒石酸、10.587 min 处为儿茶素、11.053 min 处为香豆酸、12.373 min 处为原花色素B2、13.587 min 处为表儿茶素、14.473 min 处为黄诺马苷、17.820 min 处为芦丁、18.187 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷[18-20]。

2.1.2 葡萄原汁与慕萨莱思（自酿）

图2是葡萄原汁和慕萨莱思（自酿）色谱图。

图2 葡萄原汁和慕萨莱思（自酿）在UPLC-UV-280nm下的色谱图Fig.2 The chromatogram of grape juice and mousselas at uplc-uv-280 nm

慕萨莱思成品酒物质分析按照保留时间排序，2.060 min 处为肉桂酸、2.727 min 处为没食子酸、8.113 min 处为咖啡酸、9.573 min 处为原花色素B1、9.747 min 处为4-脱氧-奎宁酸、10.760 min 处为儿茶素、11.233 min 处为香豆酸、12.507 min 处为原花色素B2、13.707 min 处为表儿茶素、14.500 min 处为黄诺马苷、17.877 min 处芦丁、18.627 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。

2.2 葡萄酒（食品系酿）与葡萄酒（进口）、慕萨莱思（阿瓦提）物质种类及含量差异

2.2.1 慕萨莱思（阿瓦提）与葡萄酒（进口）

慕萨莱思（阿瓦提）与葡萄酒（进口）色谱图如图3所示。

图3 阿瓦提慕萨莱思葡萄酒和进口葡萄酒在UPLC-UV-280nm下的色谱图Fig.3 The chromatogram of moussa and imported wine at uplc-uv-280 nm

分析图3中的色谱峰，慕萨莱思（阿瓦提）物质分析按照保留时间排序，2.233 min 处为肉桂酸、2.900 min 处为没食子酸、6.187 min 处为原儿茶酸、8.660 min 处为咖啡酸、9.567 min 处为香豆酸、9.980 min 处为4-脱氧-奎宁酸、11.027 min 处为儿茶素、13.953 min 处为表儿茶素、18.860 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。

葡萄酒（进口）物质分析按照保留时间排序，1.420 min 处为酒石酸、1.940 min 处为苹果酸、2.147 分钟处为肉桂酸、2.853 min 处为没食子酸、6.073 min 处为原儿茶酸、9.840 min 处为4-脱氧-奎宁酸、10.640 min 处为白皮杉醇、15.793 min 处为紫丁香酸、17.313 min 处为香豆酸、18.727 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、19.240 min 处为黄诺马苷。

2.2.2 慕萨莱思（阿瓦提）与葡萄酒（食品系酿）

慕萨莱思（阿瓦提）与葡萄酒（食品系酿）见图4。

图4 阿瓦提慕萨莱思葡萄酒和自酿葡萄酒在UPLC-UV-280nm下的色谱图Fig.4 The chromatogram of muthalaisi and self-brewed wine at uplc-uv-280 nm

分析图4色谱图得出，自酿葡萄酒的物质分析按照保留时间排序，1.327 min 处为酒石酸、2.367 min 处为肉桂酸、3.100 min 处为没食子酸、5.747 min 处为原儿茶酸、9.180 min 处为香豆酸、9.920 min 处为4-脱氧-奎宁酸、13.653 min 处为白藜芦醇-3-氧-葡萄糖苷、16.560 min 处为紫丁香酸、19.520 min 处为槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、19.793 min 处为黄诺马苷。

2.2.3 慕萨莱思酿造过程中及几种成品酒物质含量的变化

对慕萨莱思酿造过程中物质的变化做相对定量分析（UV-280 nm 下色谱图的峰面积）。主要涉及样品：原汁、浓缩汁、慕萨莱思（自酿）、慕萨莱思（阿瓦提）、葡萄酒（进口）、葡萄酒（食品系酿）。成分含量变化见表1。

表1 慕萨莱思酿造过程中成分含量的变化（峰面积）Table 1 Changes in composition content of moussa's brewing process（peak area）

慕萨莱思酿造过程中咖啡酸、儿茶素含量在浓缩阶段陡然升高，考虑到浓缩液体并未成倍减少，判断是在浓缩过程中复杂的原汁成分发生反应，导致咖啡酸、儿茶素含量在浓缩阶段突然升高。槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的最高含量出现在酿造结束阶段，对比成品酒中的含量，初步可以判断槲皮素-3-氧-葡萄糖苷会随着酿造阶段的完成，在陈酿阶段含量会呈现下降趋势。没食子酸的含量在慕萨莱思成品酒2 中比原汁中增加了8 倍。在慕萨莱思成品酒中的原花色素B2 的含量大于原花色素B1。表儿茶素的含量增加了大约一倍，槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量增加了1.3 倍，芦丁的含量增加了1.7 倍。香豆酸、肉桂酸和4-脱氧-奎宁酸的含量在基本保持在一个水平上。

对不同葡萄酒中的物质种类及含量进行分析，没食子酸的含量在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）样品中的含量很高，在慕萨莱思（阿瓦提）样品中含量偏低。4-脱氧-奎宁酸在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）样品中含量较高，根据样品的保存时间，由此可知样品存放时间越久，4-脱氧-奎宁酸有升高的趋势。

酒石酸在葡萄酒（进口）样品中含量较高，而在慕萨莱思（阿瓦提）和葡萄酒（食品系酿）样品中含量相差不大。肉桂酸在3 种葡萄酒中含量均较低。慕萨思（阿瓦提）中香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量高于葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿），后两者酒中香豆酸和平共处槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量均较低。咖啡酸和儿茶素在慕萨莱思（阿瓦提）中含量较高，且另外两种成品葡萄酒中未检测出。表儿茶素只在慕萨莱思（阿瓦提）中检出，苹果酸和白皮杉醇仅在葡萄酒（进口）中检出，并且三者含量均较低。由于生产工艺的不同、生产原料的不同以及生产时生产条件不同，致使每种葡萄酒中的成分也不相同。

对样品的成分进行分析，并且参考相关文献，对样品中的成分进行鉴定确定分子量、一级碎片、二级碎片[21-23]。在负离子模式下得到23 种成分，其中5 种成分目前不能确定属性，相关文献也并未进行报道。具体内容如表2所示。

表2 慕萨莱思的不同酿造时期以及进口葡萄酒、自酿葡萄酒的成分分析Table 2 The analysis of the ingredients of the different brewing period and the imported wine and the wine

通过表2可知，葡萄酒中含有较多种类的酚类物质，酚类物质有抗氧化活性，此成分对人体有益，可以进行相关的研究。同时我们可以发现有一些未知成分并未鉴定出来，这在未来的研究中可以作为一个重点来进行探索。

3 结论与讨论

3.1 慕萨莱思酿造过程中物质种类及含量变化

本研究中，对慕萨莱思的酿造过程中的原汁、浓缩汁、慕萨莱思的成品酒分别采样，检测出了慕萨莱思酿造过程中13 种物质（没食子酸、咖啡酸、原花色素B1、酒石酸、儿茶素、原花色素B2、表儿茶素、黄诺马苷、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、芦丁、香豆酸、肉桂酸、4-脱氧-奎宁酸）的含量。结果表明，检测出的物质大部分为酚类，咖啡酸、儿茶素和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量较高。

本研究在对慕萨莱思酿造过程检测结果分析发现，酚类物质占检测出物质总数量的大多数。葡萄酒中的酚类物质决定了酒的颜色、口感，使葡萄酒呈现出特殊的味道。发酵的条件、陈酿方式对葡萄酒中的酚类物质也有很大的影响。酚类物质的浸渍情况决定了葡萄酒浸渍的时间的长短[11]。如果浸渍的时间过长，单宁的含量过高，会使葡萄酒变得过于苦涩，并且单宁对发酵过程中的菌和酶有抑制作用，降低酵母菌的活力，严重的能够使酵母菌发酵停止。如果浸渍时间不足，单宁的含量太低就会使葡萄酒的口味变弱。在慕萨莱思的酿造过程中儿茶素的含量较高，但发酵过程中儿茶素的含量变化不大；原花色素B1、B2 的含量较低但变化较大，致使单宁的含量不容易控制。酚类物质在葡萄酒的酿造、储存过程中，对酒的色泽、口感的变化起到重要的作用[12]。比如，红葡萄酒中的花色素和单宁两类物质构成酒的色泽。

儿茶素在慕萨莱思酿造过程中先增加再减少，可能是因为原花色素在酸性的条件下c-c 键裂开，从而产生了少量的儿茶素，之后单体酚间发生氧化反应或聚合反应，使儿茶素的含量减少[13]。酚类物质中儿茶素及其缩合单宁对葡萄酒风味的作用最大，是红葡萄酒中苦涩味道的主要来源[14]。

慕萨莱思的酿造过程中咖啡酸含量的变化较大，在浓缩汁和慕萨莱思新酒中含量均较高。酚类物质中咖啡酸可以使葡萄酒在储藏期间的花葵素-3-葡萄糖苷的色度增加[15]，在葡萄酒发酵前加入咖啡酸有利于稳定葡萄酒的颜色，还能够防止葡萄酒氧化。Darias～Martin 等[16]的试验表明，咖啡酸对红葡萄酒颜色的稳定和防止氧化有重要作用。增加有机酸的含量可以增加红葡萄酒颜色的稳定性[17]。

3.2 慕萨莱思（阿瓦提）与葡萄酒（进口）、葡萄酒（食品系）物质种类及含量

本研究对慕萨莱思（阿瓦提）、葡萄酒（进口）以及葡萄酒（食品系酿）分别采样，检测出了15 种物质（肉桂酸、没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、香豆酸、4-脱氧-奎宁酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、苹果酸、白皮杉醇、紫丁香酸、酒石酸、黄诺马苷、白藜芦醇-3-氧-葡萄糖苷）的含量。结果表明，3 种葡萄酒中大部分物质为酚类物质并且某些酚类物质（没食子酸、酒石酸、奎宁酸）的含量较高。慕萨莱思中的肉桂酸、香豆酸含量均高于进口葡萄酒和自酿葡萄酒。咖啡酸仅在慕萨莱思检出并含量较高，苹果酸只在进口葡萄酒中检出。

本研究仅在进口葡萄酒中检测到了苹果酸，葡萄酒中的苹果酸是葡萄酒酿造过程中苹果酸-乳酸发酵（Malolactic Fermentation，MLF）重要的反应物，MLF 是葡萄酒发酵过程中改善酒的口感的重要反应[18]。经MLF之后，葡萄酒中的单体化合物减少，结合态的花色苷和单宁的比例增加，在口感质量、深度以及单宁和整体质量上均有改善。正常葡萄酒发酵经过MLF 之后苹果酸应该几乎全部消失，转化为乳酸[19]。慕萨莱思和自酿葡萄酒中未检测出苹果酸，可以表明这两种葡萄酒的MLF过程进行的比较完全，而进口葡萄酒样品中检测出少量的苹果酸，可能是MLF 过程中苹果酸转化不彻底[20]。

慕萨莱思中的咖啡酸和香豆酸含量较另外两种葡萄酒要高，咖啡酸、香豆酸都属于酚酸类物质，吕海涛等[22]的研究表明葡萄酒中的咖啡酸、香豆酸在光照、温度、酸度等变化的条件下含量的变化很大。慕萨莱思中咖啡酸和香豆酸的含量相比于葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）高，有可能是上述条件引起的葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中两种物质的含量下降[22]，或者是3 种葡萄原料本身咖啡酸、香豆酸的含量差别就很大。

3.3 结论

3.3.1 慕萨莱思酿造过程中物质含量的变化

在慕萨莱思的酿造过程中，检测出的物质大部分为酚类。含量最高的物质是咖啡酸、儿茶素、槲皮素-3-氧-葡萄糖苷。没食子酸、咖啡酸、原花色素B1、儿茶素、表儿茶素、芦丁的含量先增加再减少，原花青素B2 的含量呈先增大后减小再增大再减小的变化规律，成品酒中原花色素B2 的含量大于原花色素B1 的含量，这与李蕊蕊[23]的研究结果一致。槲皮素-3-氧-葡萄糖苷、香豆酸、肉桂酸、酒石酸的含量升高，4-脱氧-奎宁酸、黄诺马苷的含量基本保持不变。肉桂酸和4-脱氧-奎宁酸在原汁和浓缩汁均未检测出，香豆酸在原汁中未检测出。

3.3.2 慕萨莱思（阿瓦提）、葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系）3 种成品酒的差别

对慕萨莱思（阿瓦提）、葡萄酒（进口）以及葡萄酒（食品系酿）分别分析，3 种葡萄酒中没食子酸的含量均较高，4-脱氧-奎宁酸在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中含量较高，酒石酸在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中含量较高但在慕萨莱思（阿瓦提）中未检测出，肉桂酸在3 种葡萄酒中含量均较低。慕萨莱思（阿瓦提）中的原儿茶酸的含量要低于葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿），原儿茶酸在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中的含量相差不大。慕萨莱思（阿瓦提）中香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量高于葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿），香豆酸和槲皮素-3-氧-葡萄糖苷的含量在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中的含量均较低。葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）中未检测出咖啡酸和儿茶素，但咖啡酸和儿茶素在慕萨莱思（阿瓦提）中有较高的含量。表儿茶素只在慕萨莱思中检出，苹果酸和白皮杉醇仅在葡萄酒（进口）中检出，并且3 者含量均较低。紫丁香酸和黄诺马苷在葡萄酒（进口）和葡萄酒（食品系酿）含量差别不大，但在慕萨莱思（阿瓦提）中未检测出，白藜芦醇-3-氧-葡萄糖苷只在葡萄酒（食品系酿）中有检出。