黄芪甲苷通过抑制细胞凋亡减轻缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞损伤的研究

张 怡，周晓红，靳晓飞，董贤慧，于文涛，张 颖，成 媛，高维娟

(河北中医学院，河北省中医药防治心脑血管病基础研究重点实验室， 石家庄 050091)

中风(stroke)具有高发病率及高致死致残率的特点，是造成我国居民死亡的首位原因。中风分为出血性中风和缺血性中风，其中大多数患者属于缺血性中风(87%)[1]。大量研究证实梗死组织周边缺血半暗带血流的恢复再通是减轻脑缺血临床症状的最有效的治疗策略，然而，伴随而来的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)的发生有时却会造成更为严重的脑损伤[2]。脑组织中心缺血区内神经元以坏死为主，而缺血半暗带内可逆性的细胞凋亡是主要的细胞死亡机制，与最终的梗死面积密切相关[3]。中药黄芪是传统的益气活血药，在治疗中风方面具有数千年的历史[4]。本课题组前期研究发现：黄芪注射液可有效减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，抑制神经元凋亡的发生[5]。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，其是否能通过抑制细胞凋亡减轻缺氧缺糖/复氧复糖(oxygen and glucose deprivation/ reoxygenation, OGD/R)HT22细胞损伤有待进一步探究。因此，本研究以常用于神经系统疾病研究的HT22细胞为对象，通过OGD/R模拟脑缺血再灌注损伤过程，探讨黄芪甲苷在OGD/R损伤中的神经保护作用及具体作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

HT22细胞(小鼠海马神经元细胞系)，由河北医科大学附属第一医院实验中心许顺江教授惠赠。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基、胰蛋白酶均购于美国Gibco公司；青链霉素混合液购自BIOND公司；Triton X-100、多聚赖氨酸均购自北京索莱宝科技有限公司，Bcl-2单克隆抗体购自Abcam公司；Bax多克隆抗体、Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG、Cy3标记驴抗兔IgG、DAPI染液均购自武汉谷歌生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI 双染色试剂盒购于BD公司；黄芪甲苷(纯度>98%)购于上海源叶生物科技有限公司。

超净工作台SW-CJ-ID型购于苏州净化公司；二氧化碳(CO2)培养箱3111型、三气培养箱3131型及多功能微孔板读数仪Varioskan LUX型购于Thermo公司；倒置显微镜DMI3000B型、荧光显微镜DM5000B型购于Leica公司；流式细胞仪FC 500 MCL 型购于Beckman公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HT22细胞培养

HT22细胞采用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM高糖细胞培养液并置于CO2培养箱(37℃，5% CO2，饱和湿度)中进行培养，细胞复苏后培养1～2代后进行OGD/R模型建立。

1.3.2 HT22细胞缺氧缺糖/复氧复糖模型的建立及实验分组

将HT22细胞随机分为4组：正常对照组(Control)、缺氧缺糖/复氧复糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)组(Model)、黄芪甲苷组(AS-IV)和溶剂对照组(DMSO)。除正常对照组外，其余各组细胞均氧糖剥夺6 h后进行复氧复糖，建立缺氧缺糖/复氧复糖细胞模型：弃去HT22细胞正常细胞培养液(含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM高糖培养液)，PBS洗2次后加入DMEM无糖培养基，然后放入含94% N2+5% CO2+1% O2的37℃三气培养箱中培养6 h，将DMEM无糖培养基更换为正常细胞培养液，放入37℃ 5% CO2培养箱中继续培养。AS-IV组于复氧复糖的同时给予黄芪甲苷处理(终浓度为100 μmol/L)，24 h后观察细胞形态并进行指标检测。

1.3.3 CCK-8测细胞活性

各组细胞于OGD/R 24 h 后分别于96孔板中每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃ 5% CO2培养箱中孵育45 min后在多功能微孔板读数仪中测OD 450 nm值，检测细胞活性。

图1 光学显微镜下各组细胞形态学观察(×200)Figure 1 Morphological observation of the cell morphology in each group under an optical microscope

1.3.4 LDH漏出率检测

在96孔板中加入细胞上清液及LDH试剂，混匀，室温静置5 min后在多功能微孔板读数仪中测OD 450 nm值，此为细胞上清中LDH释放量。向原含细胞的培养板中加入1% Tritonx-100，室温反应20 min后取细胞反应液及LDH试剂混匀，室温静置5 min，450 nm测定吸光值为细胞破膜液LDH释放量。LDH漏出率(%)=上清LDH /(上清LDH+细胞破膜液LDH)×100%。

1.3.5 Bax、Bcl-2免疫荧光检测

将细胞爬片用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)固定20 min；含1%Triton X-100的PBS液破膜15 min；BSA室温孵育30 min；甩掉封闭液后先后滴加配好的Bax多克隆抗体(1∶100)和Bcl-2单克隆抗体(1∶100)，4℃孵育过夜；PBS洗去一抗后滴加Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG(1∶300)和Cy3标记驴抗兔IgG(1∶100)，避光室温孵育50 min；PBS洗去二抗后滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min；封片；每张细胞爬片随机选取3个视野进行拍照。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

吸出并收集细胞上清液，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞后用预冷的PBS清洗两遍，加入100 μL 1×binding buffer 重悬细胞后再分别加入FITC和PI染液各5 μL，室温避光反应15 min，加入400 μL 1×binding buffer，上机检测细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 倒置显微镜观察缺氧缺糖/复氧复糖 HT22细胞的形态变化

Control组细胞表现为贴壁生长，细胞呈两极或多极，突起明显，突起之间相互交织成网状，胞体折光性强；与Control组相比，Model组和DMSO组细胞胞体突触明显减少，细胞皱缩、变圆，胞质凝聚，细胞间连接大量减少，细胞贴壁不紧，部分细胞团脱落，胞体折光性下降；与Control组比较，AS-IV组上述表现有所缓解。见图 1。

2.2 CCK-8检测缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞活性

与Control组相比，Model组、DMSO组及AS- IV组细胞活性均显著下降(P<0.05)；与Model组比较，AS- IV组细胞活性显著升高(P<0.05)，DMSO组细胞活性无差别。见 图2。

2.3 缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞LDH漏出率

与Control组相比，Model组、DMSO组及AS- IV组LDH漏出率均显著升高(P<0.05)；与Model组比较，AS- IV组LDH漏出率显著降低(P<0.05)，DMSO组细胞LDH漏出率无差别。见图3。

注：与对照组相比，*P<0.05, **P<0.01。与模型组相比，#P<0.05, ##P<0.01。图2 缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞活性检测Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 2 Viability of the HT22 cells treated by OGD/R was determined by CCK-8 assay

注：与对照组相比，*P<0.05, **P<0.01。与模型组相比，#P<0.05, ##P<0.01。图3 缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞LDH漏出率Note. Compared with the Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with the Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 3 LDH level (%) of the HT22 cells treated by OGD/R

2.4 免疫荧光检测缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞Bcl-2、Bax表达

与Control组相比，Model组细胞Bax/Bcl-2显著升高(P<0.05)，AS-IV组细胞Bax/Bcl-2仅有升高趋势(P>0.05)；与Model组比较，AS-IV组细胞Bax/Bcl-2显著降低(P<0.05)。见图4。

2.5 流式细胞术检测缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡率

与Control组相比，Model组及AS-IV组细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)；与Model组比较，AS-IV组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。实验结果与免疫荧光检测结果相似。见图5。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是脑缺血溶栓治疗及外科手术治疗中的常见并发症，指脑组织在缺血情况下恢复血流供应后损伤加重的现象[6]。CIRI发生机制十分复杂，细胞内Ca2+超载、自由基过量生成、兴奋性氨基酸毒性、炎症级联反应、细胞调亡等各种机制先后或重叠发生[7]，各种因素累积叠加，形成恶性循环，最终造成脑组织不可逆的损伤。

研究证实细胞凋亡为CIRI继发性损伤发生的重要机制。脑缺血发生后，缺血中心区内血流减少并伴随着不可逆的神经细胞坏死，而细胞凋亡则主要存在于缺血半暗带并对最终脑梗死面积具有决定作用[8]。脑缺血后线粒体外膜通透性增加，细胞色素C(cytochrome C)由线粒体释放入胞质，从而激活caspase-3级联反应，最终导致DNA降解[9]。此过程中，Bcl-2家族成员调控着蛋白的易位和激活[10]，CIRI后由于缺血等刺激使Bax易位至线粒体并增强线粒体膜通透性，导致cytochrome C和AIF的释放，从而引发细胞凋亡的发生，而Bcl-2则通过稳定线粒体膜电位和阻止cytochrome C释放来抑制细胞凋亡，Bcl-2与Bax两者的比例是决定细胞凋亡发生与否的重要因素[11-12]。

注：荧光图片：绿色，Bcl-2；红色，Bax；蓝色，DAPI。注：与对照组相比，*P<0.05, **P<0.01。与模型组相比，#P<0.05, ##P<0.01。图4 免疫荧光染色检测缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞Bax和Bcl-2的比例Note. Fluorescent images: green,Bcl-2；red, Bax；blue, DAPI. Compared with Control group,*P<0.05, **P<0.01. Compared with Model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 4 Comperison of the Bax/Bcl-2 ratios of the OGD/R treated HT22 cells. Immunofluorescence staining

图5 流式细胞术检测缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡率Figure 5 Changes of the apoptosis rates in HT22 cells examined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining

黄芪始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，味甘，性微温，具有补气固表、利尿消肿、托毒生肌之功效，临床上常用于治疗脾胃虚弱、表虚自汗、脓毒溃疡、半身不遂等症[13]。黄芪用于治疗中风具有数千年的历史，更为治疗缺血性中风常用方——补阳还五汤中的君药，目前广泛应用于临床脑血管病的治疗。黄芪甲苷为黄芪主要活性成分之一，具有清除氧自由基、抑制细胞凋亡、抗炎、抗血小板凝集等生物活性[14]。研究证实黄芪甲苷能有效降低脑缺血再灌注损伤小鼠海马CA1区神经细胞凋亡率，抑制caspase-3蛋白的表达，对受损脑组织发挥神经保护作用[15]。

缺氧缺糖/复氧复糖是一种公认的用以模拟脑缺血再灌注损伤研究的体外模型[16]，本研究以HT22细胞为实验对象，通过缺氧缺糖/复氧复糖模拟脑缺血再灌注损伤过程，采用黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞进行处理，旨在探讨黄芪甲苷对脑缺血再灌注损伤后发挥神经保护作用的机制。研究结果证实：缺氧缺糖/复氧复糖导致细胞活力显著下降，LDH漏出率增加，细胞损伤严重；而给予黄芪甲苷处理后，细胞活力显著升高，LDH漏出率显著下降，细胞损伤明显减轻，证实黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞具有保护作用。在此基础上又进一步探索了黄芪甲苷的作用机制。通过观察HT22细胞Bax/Bcl-2及凋亡率的变化，探索黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞凋亡的影响。研究发现，缺氧缺糖/复氧复糖导致HT22细胞Bax/Bcl-2及凋亡率显著升高，细胞凋亡严重；而给予黄芪甲苷处理后HT22细胞Bax/Bcl-2及凋亡率均显著下降，说明黄芪甲苷可通过抑制细胞凋亡发挥对缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞的保护作用。基于上述研究，本课题组拟通过离体和在体实验两方面进一步探讨黄芪甲苷发挥凋亡调控作用的具体通路。