沉默miR-222上调PUMA基因表达诱导高转移潜能腺样囊性癌细胞凋亡*

周子亮 曾秉辉 魏常博 余东升

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)属于多见的涎腺肿瘤[1]，强侵袭性与早期转移是其重要特征[2]。目前SACC的标准治疗方法是手术切除肿瘤并结合术后放疗[3]。然而，术中无法完全切净的肿瘤细胞以及肿瘤的早期远处转移是影响SACC预后的主要原因[4]。微小RNA(MicroRNA，miRNAs)是一类非编码的单链RNA小分子[5]。其中，miR-222是一种具有促癌作用的miRNA。有研究发现在口腔鳞癌等肿瘤细胞中，miR-221和miR-222表达上调，并与肿瘤的生长活性密切相关[6-8]。然而，关于miR-222在转移性腺样囊性癌细胞中作用的研究是不充分的。p53上调凋亡调控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是Bcl-2家族的一员，位于p53的下游，有强大的促凋亡效应[9]。Karst等[10]用免疫组织化学以及组织芯片的方法检测PUMA的表达，结果提示PUMA的表达抑制与肿瘤发生紧密相关。本文选用涎腺高转移潜能腺样囊性癌细胞SACC-LM，着重检测miR-222与PUMA表达的相关性是否具有特殊性，并观察细胞迁移、增殖、凋亡等行为的变化，希望发现涎腺转移性腺样囊性癌的潜在治疗靶点。

1.材料与方法

1.1 主要材料与试剂 DMEM-高糖培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)和青链霉素购自美国Hy Clone公司；Opti-MEM培养基、Trizol裂解液及LipfectamineTMRNAiMAX转染剂(Invitrogen公司，美国)；Trypsin-EDTA溶液(Sigma，美国)；由上海吉玛公司合成反义miR-222与反义miR-222 NC；PUMA一抗(CST，美国)；抗兔IgG二抗(碧云天，中国)；BCA蛋白定量试剂盒(生工，中国)。

1.2 细胞培养 在含10%FBS与双抗(100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)的DMEM-高糖培养基培养SACC-LM细胞。在37℃恒温孵育箱中，以5%CO2、95%饱和湿度培养，每隔24h更换1次溶液。

1.3 细胞转染 对数期SACC-LM细胞以1×105个/孔接种在六孔板中，并置于恒温培养箱中过夜。当汇合度为50%时，用1ml无血清无抗生素培养基替换每个孔溶液。配制终浓度为20μmol/L的反义miR-222培养基 600μl(A液)。于 600μl Opti-MEM 培养基中加入 6μl LipfectamineTMRNAiMAX，混匀并静置(B液)。10min后，将A、B液混匀，静置30min。每个孔加入1ml混合液并在37℃放置4h，然后用含有血清的培养基替换。类似地，通过相同的方法将具有FAM荧光标记的As-miR-222 NC转染到SACC-LM细胞中。

1.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)收集转染细胞用Trizol裂解，再用DNaseⅠ除去基因组DNA。分别以18Sr RNA与U6 snRNA为PUMA和miR-222的内参设计引物。18Sr RNA引物为5'-CCTGG-ATACC-GCAGC-TAGGA-3'(Forward)，5'-GCGGC-GCAAT-ACGAA-TGCCCC-3'(Reverse)；U6 snRNA引物为5'-CTCGCTTCGG-CAGCA-CA-3'(Forward)，5'-AACG C-TTCAC-GAATT-TGCGT-3'(Reverse)；PUMA引物为5'-GGGCC-CAGAC-TGTGA-ATCC-3'(Forward)，5'-TCACA-CGTGC-TCTCTCTAAA-CC-3'；miR-222引物为5'-ACACTCCAGC-TGGGA-GCTAC-ATCTG-GCTACTG-3'(Forward)，5'-CTCAA-CTGGT-GTCGTGGA-3'(Reverse)。用ΔΔCT法进行数据统计分析。

1.5 蛋白印迹试验(Western Blot) 将细胞在冰上裂解30min，同时加入PMSF，并取上清以测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后蛋白转至PVDF膜。将5%脱脂奶粉在37℃下孵育一小时，在4℃下加入一抗过夜，并用二抗在37℃下孵育一小时。用TBST洗膜3次，加入化学发光溶液，并显影。

1.6 Transw ell迁移实验 转染后收集、计数1×105个细胞。在Transwell培养板上室中加入80μl细胞重悬液，并向下室添加500μl有血清的培养基。细胞培养箱中培养12h后，对小室下室侧细胞进行固定染色。采用显微镜观察计数，以x±s表示，评估细胞迁移能力。

1.7 CCK-8检测细胞增殖 转染48小时后，将细胞以1000个/孔接种在96孔板中，并在每组中设置4个复孔。按时间点(0，24，48，72 h)收集细胞，每孔加入10μl CCK-8溶液。在37℃中放置4h后，用酶标仪读出OD450的数值并计算，绘画增殖曲线。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期 基因转染48h后，向每组收集1×106个细胞，用预冷的PBS洗涤。取0.5ml细胞重悬液，加入Annexin V-FITC 1.25μl，常温暗室放置15min。离心收集细胞，用预冷的缓冲液重悬，加入10μl碘化丙啶(PI)，冰上避光孵育10min，随即用流式细胞仪分析凋亡情况。同样的方法收集与洗涤细胞，加入预冷的70%乙醇4℃过夜固定。离心收集细胞并用PBS洗一次，加入500μl PBS(含50μg/ml碘化丙啶，0.2%Triton X-100，100μg/ml RNase A)，4℃避光放置30 min，随即用流式细胞仪分析周期分布。

1.9 统计学分析 用SPSS 20.0统计学软件分析数据。通过两独立样本t检验进行样本的两两比较，并通过单因素方差分析比较多组样本。假设为双侧检验，检验水准为α=0.05。

2.结果

2.1 转染效率检测 As-miR-222 NC带有FAM标签，细胞转染6h后，荧光显微镜下观看FAM荧光基团如图所示(图1)，表明转染效率较高，可达80%。

图1 荧光倒置显微镜下观察SACC-LM细胞转染效率(×100)

2.2 检测基因转录水平 细胞转染后用qRTPCR检测miR-222与PUMA的转录情况(图2)。转染As-miR-222后，实验组miR-222表达水平明显下调(P＜0.05)，PUMA转录水平显著增加(P＜0.01)，差异有统计学意义。

图2 转染对miR-222和PUMA基因mRNA表达水平的影响

2.3 检测细胞PUMA蛋白表达水平 Western Blot结果可见，实验组PUMA蛋白表达显著增强(图3)。使用Image J软件，测量目标蛋白PUMA和内参蛋白GAPDH的灰度值，并计算两者的比值为(0.496±0.016)、(0.474±0.006)和(0.875±0.058)。转染后实验组PUMA蛋白表达显著增加(P＜0.01)，提示miR-222的沉默可以消除其对PUMA的靶向抑制作用。

图3 转染后SACC-LM各组细胞PUMA蛋白的表达情况

2.4 检测细胞迁移能力 计算每组中细胞迁移的数量(表1)，数据显示实验组中通过小室的细胞数量显著减少(P＜0.01，图4)，说明抑制miR-222可降低SACC-LM细胞的运动能力。

图4 转染后SACC-LM细胞迁移实验检测(×100)

表1 各组SACC-LM细胞的迁移数目(×100)

2.5 检测细胞增殖能力 计算各组的OD450比值，画图反映出各个时间点的细胞生长状况。结果显示阴性对照组细胞的增殖变化不明显，而实验组细胞的增殖则有显著降低(P＜0.01，图5)。提示miRNA-222的确能促进高转移潜能涎腺腺样囊性癌细胞SACC-LM增殖，通过沉默miRNA-222表达能抑制细胞增殖。

图5 转染后SACC-LM细胞的增殖情况

2.6 检测细胞凋亡情况与周期分布 流式细胞术检测细胞凋亡，总细胞凋亡率分别为18.59%、19.65%和27.13%，实验组凋亡率显著增加(P＜0.01，图6)。同样，检测细胞周期，实验组G0/G1期的细胞比例显著增加，而S期和G2/M期则相应减少(P＜0.01，表2)。说明沉默miRNA-222能影响SACC-LM细胞周期分布，并促进其凋亡。3.讨论

图6 转染后SACC-LM各组细胞凋亡情况

表2 转染后各组细胞周期分布(x±s，%)

PUMA在细胞的凋亡过程中起重要作用[11，12]。有研究表明，细胞凋亡的行为能防止肿瘤的发生[13]，若PUMA基因突变或缺失，则使凋亡的发生率降低。在恶性肿瘤中，PUMA上游基因p53受损、PUMA启动子甲基化、Bcl-2蛋白家族抗凋亡蛋白过表达等因素均能导致PUMA等表达降低，抑制PUMA的促凋亡功能[14]。可以看出，通过过表达肿瘤细胞的PUMA基因，可以增强PUMA介导的细胞凋亡效应，以达到治疗肿瘤的目的。

越来越多的miRNAs被研究所证实与肿瘤生长、分化、迁移、侵袭、转移、凋亡等行为密切相关，是肿瘤治疗的潜在靶点[15]。miRNAs在许多肿瘤中表达是异常的[16]，可以看出它在肿瘤的发展中起重要作用。其中，miR-222是常见的促癌miRNAs，在一些肿瘤中高表达，如脑胶质母细胞瘤[17]、甲状腺乳头状癌[18]、前列腺癌[19]等，并与其生长密切相关。Zhang[20]等报道抑制miR-222能上调脑胶质母细胞瘤细胞表达PUMA，并促进细胞凋亡。提示miR-222可以负调节PUMA的表达并影响细胞。miR-222与miR-221是成簇分布的miRNA，二者相邻并呈前后排列，人miR-221/222核心序列完全同源，有报道PUMA与PTEN是其主要的共同靶基因[21，22]。其中，PTEN能阻断PI3K/Akt信号通路，抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡[23]。Yang等[6]发现miR-221和miR-222同时在口腔鳞癌中高表达，且表达水平与肿瘤生长活性高度相关。同时沉默miR-221/222可使PUMA与PTEN显著上调[21]。提示以miR-221和miR-222作为联合靶点的基因治疗可能更具优势，值得进一步的探索。

本实验通过向高转移潜能腺样囊性癌细胞SACC-LM转入反义链，沉默细胞内源性miR-222，进而提高细胞表达PUMA。并进一步通过细胞功能实验证实，上调SACC-LM细胞的PUMA表达水平，有助于抑制其增殖、迁移的能力，并显著影响细胞周期，诱导凋亡的发生。综上所述，本研究通过沉默miR-222上调PUMA表达，揭示出治疗转移性腺样囊性癌的潜在靶点，并有望为临床开发抗癌药物提供参考。