软枣猕猴桃果胶降解工艺优化及降解产物抗氧化活性研究

康振宇，吴 优，赵奕彭，邢 尧，康宗利，杨玉红

（沈阳农业大学 生物科学与技术学院，沈阳，110161）

氧化胁迫与衰老及多种疾病的发生密切相关，因此发掘和筛选天然抗氧化剂是现代医药、保健及食品工业的发展趋势。植物是最具潜力的天然抗氧化剂资源，已有的研究表明,植物中具有抗氧化活性的成分主要包括多酚、黄酮、花青素等一系列小分子化合物[1-2]。果胶是一类广泛分布于高等植物细胞初生壁和细胞间层的酸性杂多糖，具有较好的抗氧化性能[3-5]。然而，果胶的生物活性与其相对分子量大小有关。相对分子量越大，越不利于多糖跨越多重细胞膜障碍而进入生物体内发挥生物学活性[6-7]。目前工业生产中，获得果胶寡糖的主要途径一是直接从天然植物中浸提，但提取率低；二是利用生物化学法人工合成，但工艺复杂，生产效率低下[8]。因此，通过现代酶工程技术、修饰或降解果胶分子制备相应的功能性寡糖，成为获取新一代功能性食品资源的重要途径。

软枣猕猴桃是猕猴桃科、猕猴桃属的大型落叶藤本植物，别名软枣子，是我国东北地区大面积栽培的优势资源[9-10]。软枣猕猴桃含有丰富的碳水化合物、维生素及芳香化合物，特别是其所含有的纤维成分，有三分之一是果胶[11-13]。然而，有关软枣猕猴桃果胶成分的开发利用却尚未见报道。本研究以野生软枣猕猴桃果实中提取的果胶为原料，采用响应面法来对软枣猕猴桃果胶的酶降解果胶过程中的果胶酶的活力大小、料液的比例、果胶的酶降解温度和果胶的酶降解时间进行优化，以期为低聚糖的大规模生产和质量控制提供了技术手段，为分子水平效应机理的研究奠定了基础。

电休克治疗是所有抗抑郁治疗中，有效率和缓解率最高的治疗，70%-90%的患者病情有改善。因此，难治型抑郁症患者可考虑使用电休克疗法。电休克疗法对一些严重抑郁症患者特别有效，可作为初始治疗方案。ECT治疗的副作用包括认知损害和遗忘等，一般在治疗结束后恢复。因此，电休克疗法整体上较为安全。

压力钢管纵缝焊接，采用气体保护焊打底、气刨清根、双面埋弧焊方法，埋弧焊的纵缝内侧焊可直接铺设轨道，为埋弧焊内侧平焊；但外侧平焊需要将焊缝转动到顶部位置，由于钢管属于弧面，2m以上施工属于高空作业，存在施工安全风险。采用一种可翻转的纵缝焊接平台，解决了施工安全问题，并提供了一个平稳的施工工作面，如图1所示。

1 材料与方法

1.1 材料

软枣猕猴桃由沈阳农业大学提供；不同酶活力的果胶酶（1000，2000，3000，4000，5000，6000U·g-1）（上海生物科技有限公司）；半乳糖醛酸（纯度≥97%）（上海金惠生物科技有限公司）；邻苯三酚、Na2HPO4、NaH2PO4、乙醇等（上海国药集团，均为分析纯）。

场地仅钻孔（CK3、CK9-10、ZK10-11、ZK14-15、ZK18、ZK21） 有揭露，揭露层厚2.20～3.40m，平均厚度 2.91m；层顶高程-0.75～0.60m，层顶深度 3.20～4.40m。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理 将软枣猕猴桃清洗干净，将其捏碎搅拌制成匀浆，放入容器内备用。

1.2.2 软枣猕猴桃果胶的提取 准确称取一定量经过预处理的软枣猕猴桃果浆，加入一定量的蒸馏水，并加25%的盐酸调节pH值为2.3，在80℃条件下加热80min后，过滤收集滤液，置于容器内。待滤液恢复至室温时，向滤液中加入等体积95%乙醇，之后静置30min，使果胶充分沉淀。接着用布氏漏斗进行抽滤，得到果胶沉淀。最后在70℃的条件下对果胶沉淀进行干燥处理，得到果胶粗品[14-15]。

中国食品工业总产值从百亿元级到万亿元级的背后，是众多功勋人物、领军人物孜孜以求、攻坚克难的不懈努力，是众多食品企业争创百年老店、力求让消费者满意的永恒追求。

1.2.3 果胶的酶解工艺 准确称取果胶粗品10g于100mL烧杯中，加入20mL蒸馏水和果胶酶5000U·g-1在45℃、pH值5.0条件下降解2h。用果胶酶处理结束后，立刻在70℃的条件下干燥，待干燥后称取干重，备用。

1.2.4 软枣猕猴桃果胶降解的单因素试验

1.2.4.1 料液的比例对果胶降解效果的影响 将提取后的果胶分别称取10g，控制反应条件为：降解温度50℃，降解时间 2h，果胶酶活力为 5000U·g-1，考察不同料液比（1∶1，1∶3，1∶5，1∶7，1∶9g·mL-1）对果胶降解的影响。

德兴铜矿泗洲选矿厂一期磨浮工段现有3台清水泵为现场提供清水用水，由于水库水源杂质较多，清水泵工作时间较长，这必然会引起清水泵的堵塞导致清水泵不能正常工作，为此在清水泵进水处安装1台清水过滤装置以过滤掉杂质，但是外购过来的过滤装置过滤效果往往不太理想，并且还十分昂贵，考虑过滤效果和管控成本，针对这一难题，在清水泵进水水源处设计安装一套自清洗水源过滤装置［3］很有必要。

按照1.2.6.2操作方法，绘制半乳糖醛酸曲线（图1），得到半乳糖醛酸标准曲线方程为：

1.2.5 响应面优化试验 依据Box-Behnken Design（BBD）设计原理，选取料液比、果胶酶活力、降解时间、降解温度为试验因素，以测得的果胶降解率为响应值，设计四因素三水平的响应面分析，试验因素与水平设计见表（表 1）。

所得数据采用Design Expert 8.0.6进行统计分析。

1.2.4.4 降解温度对果胶降解效果的影响 将提取后的果胶分别称取10g，控制反应条件为：降解时间2h，料液比 1∶5g·mL-1，果胶酶活力为 5000U·g-1，考察不同降解温度（30，35，40，45，50，55℃）对果胶降解的影响。

讨论人员: 吕晓琴 冯小勤 李将萍 戴淑婷 韩姬玲 邓俊萍 刘玉虎 相跃邦 蒋学琴 罗淑珍 许保红 王素琴 畅巨颖 张海珍 周 青 曹春歌 张晓敏 康茹冰

1.2.6 果胶降解率的测定及计算

1.2.6.1 果胶降解率的测定 以半乳糖醛酸标准品作对照，借助咔唑比色法原理测定软枣猕猴桃中果胶的降解率，方法基于果胶物质水解,生成半乳糖醛酸在强酸中与咔唑的缩合反应，然后对其紫红色呈色溶液进行比色定量[16]。首先，取1mL酶解液于6mL浓硫酸的试管内，振荡混匀，85℃水浴加热15min，经冷却后，加入0.3mL 0.15%咔唑乙醇溶液，摇匀，黑暗处放置30min，最后在530nm下测定其吸光度。根据标准曲线和以下公式求得酶解液中软枣猕猴桃果胶降解率。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Response surface experimental factors level table

式中：Ei为果胶的降解率；C0为空白对照中果胶半乳糖醛酸的含量；Ci为加酶处理后的果胶半乳糖醛酸的含量。

1.2.6.2 半乳糖醛酸标准曲线的绘制 准确称取0.1000g软枣猕猴桃果胶半乳糖醛酸标准品，至100mL容量瓶中，用 pH=3 的盐酸定容。 取 0，1，2，3，4，5，6，7mL 于 8 个 100mL 容量瓶中，用 pH=3 的盐酸定容，得到浓度为0，10，20，30，40，50，60，70μg·mL-1的标准溶液，采取咔唑比色法测定 OD 值，根据 OD 值和底物浓度绘制标准曲线，横坐标为软枣猕猴桃果胶半乳糖醛酸的浓度，纵坐标为530nm处的吸光值，再根据半乳糖醛酸标准曲线计算出半乳糖醛酸的含量。

然后对评价结果向量B进行处理,参考使用模糊向量单值法[13]。给4个信任等级依次赋予数值(c1=0.2,c2=0.5,c3=0.7,c4=0.95),需要满足c1

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的测定 参照文献，控制反应条件[17]：果胶酶的活力大小5000U·g-1、料液的比例1∶5g·mL-1、果胶的酶降解时间2.5h、果胶的酶降解温度45℃进行果胶酶降解，得到果胶的酶降解液后，使用0.22μm滤膜过滤除菌，得到果胶的酶降解液。准确量取10mL的果胶降解溶液，分别稀释成20，40，60，80，100mg·mL-1的不同梯度，分别量取1mL不同梯度的果胶降解溶液，接着再向每个试管中加入2mL浓度为0.15mmol·L-1的DPPH溶液后，振荡混匀后，放置在避光的条件下，进行暗反应30min。待反应结束后立刻在517nm波长下测定其OD值并准确记录，无水乙醇作为空白对照。

式中：Ai为2mL DPPH溶液与1mL果胶降解溶液；Ai0为2mL无水乙醇与1mL果胶降解溶液；A0为2mLDPPH溶液与1mL无水乙醇。

1.2.7.2 超氧阴离子自由基(O2-)清除能力的测定 参照任雪峰等[18]方法，按照1.2.7.1的方法配制果胶降解溶液，分别量取1mL不同梯度的果胶降解溶液，加入4.5mL，pH值8.2，0.1mol·L-1Tris-HCl缓冲溶液，2.4mL蒸馏水混匀，10min后加入0.1mL，6mmol·L-1的邻苯三酚溶液，混匀，计时4min后立即加入0.1mL，10mmol·L-1的HCl终止反应。另以蒸馏水为空白对照，在325nm处测定吸光度，记录OD值。

2.2.1 料液比对软枣猕猴桃果胶降解效果的影响 由图2可知，果胶降解产物的降解率随料液比的增大呈现先升高后下降的趋势；当料液比为1∶5g·mL-1时，果胶的降解率最大，为37%；继续增加料液比，果胶降解产物的降解率反而逐渐下降，分析可能是因为溶剂量过大，导致原料的物质分子间相互作用减弱[21]。因此，选择料液比为 1∶5g·mL-1进行后续试验。

1.2.7.3 烷基自由基(R-)清除能力的测定 参照李亚辉等[19]方法，按照1.2.7.1的方法配制果胶降解溶液，分别量取1mL不同梯度果胶降解溶液，加入6mmol·L-1的过氧化氢溶液1mL，再加入10mmol·L-1的水杨酸溶液1mL和0.5mL 1.5mmol·L-1的FeSO4溶液，混匀后在37℃恒温水浴条件下反应60min。反应结束后在562nm处测定吸光值并准确记录，用蒸馏水作为空白对照，VC作为阳性对照品。

式中：Ai为空白组吸光值；A0为样品溶液吸光值。

1.2.7.4 还原能力的测定 参照SÁNCHEZ-MORENO[20]方法，按照1.2.7.1的方法配制果胶降解溶液，分别量取1mL不同梯度果胶降解溶液，加入2.5mL磷酸缓冲盐溶液、2.5mL浓度为1.0%的铁氰化钾溶液，使其充分混合后，50℃水浴23min，待反应结束后向各管中分别加入2.5mL浓度为10%的三氯乙酸，待反应结束，再向各试管内添加2.5mL蒸馏水和0.5mL浓度为0.1%的FeCl3溶液。让各试管溶液充分反应。反应结束后立刻在535nm波长下测定OD值并准确记录，另以蒸馏水为空白对照。

1.3 数据处理

1.2.4.3 降解时间对果胶降解效果的影响 将提取后的果胶分别称取10g，控制反应条件为：降解温度50℃，料液比 1∶5g·mL-1，果胶酶活力为 5000U·g-1，考察不同降解时间（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h）对果胶降解的影响。

2 结果与分析

2.1 半乳糖醛酸标准曲线

1.2.4.2 果胶酶活力对果胶降解效果的影响 将提取后的果胶分别称取10g，控制反应条件为：降解温度50℃，降解时间 2h，料液比 1∶5g·mL-1，考察不同果胶酶活力大小（1000，2000，3000，4000，5000，6000U·g-1）对果胶降解率的影响。

2.2 单因素试验结果

9、停止抽真空，关闭抽空阀门，缓慢开启储油柜下部及瓦斯继电器两端阀门，将储油柜中的变压器油放入变压器内，并调整油位到合适位置。补油结束后，打开套管升高座、联管等上部的放气塞进行放气，待油溢出时关闭塞子。

1.2.7 抗氧化性试验

2.2.2 果胶酶活力对软枣猕猴桃果胶降解效果的影响 由图3可知，果胶降解产物的降解率随果胶酶活力的增大呈现先升高后下降的趋势；当果胶酶的活力大小为5000U·g-1时，果胶的降解率最大，为43%；继续增大果胶酶活力，果胶降解产物的降解率反而下降。因此，选择酶活力大小为5000U·g-1进行后续试验。