连翘炒制前后多种成分含量比较及工艺初探*

丁芳芳 张 瑞 吕慧利

连翘，为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)的干燥果实，连翘首载于《神农本草经》，言其“味苦、平，主寒热，鼠瘘瘰疠，痈肿恶疮，瘿瘤，结热”。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，现代研究表明，连翘具有抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌等都具有明显的抗菌活性[1，2]，以及抗病毒、抗炎、抗氧化、抗过敏、抗癌活性[3]，山西为连翘的主产区之一，上党地区的名医们在临床实践中，积累了诸多应用连翘的心得，他们认为连翘过于苦寒，在治疗内科杂病时，根据患者病情，于入药前将连翘炒制，去性存用，为山西上党地域的经验用药。本次研究选取连翘中3个主要有效成分：连翘苷、连翘酯苷、芦丁为检测目标，观测其炮制前后含量变化，初步探讨炒连翘的物质基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器安捷伦1260高效液相色谱仪，DEAAX08007二极管阵列检测器，KQ-500DB数控超声波清洗器，FLUKE F59红外测温仪。

1.2 药品与试剂连翘酯苷标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17022405)，连翘苷标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17031610)，芦丁标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司，MUST-17122001),甲醇为色谱纯，水为超纯水，论文中所涉及的其他试剂均为分析纯。连翘为山西连翘，批号分别为：20170403,20171001,20171006，粉碎过5号筛。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 连翘苷的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈-水(25∶75)为流动相洗脱，检测波长为277 nm；流速0.8 ml·min-1，柱温为室温，理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000[4]。

2.1.2 连翘酯苷的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85)为流动相洗脱，检测波长为330 nm；流速0.6 ml·min-1，柱温为室温，理论板数按连翘酯苷峰计算应不低于5000[4]。

2.1.3 芦丁的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(45∶55)为流动相洗脱，检测波长为365 nm；流速1 ml·min-1，柱温为室温，理论板数按芦丁峰计算应不低于2000[5]。

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 连翘苷对照品溶液的配制精密称取连翘苷对照品6.62 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，既得浓度为327.92 μg·ml-1的对照品溶液。

2.2.2 连翘酯苷对照品溶液的配制精密称取连翘酯苷对照品2.63 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，既得浓度为130.63 μg·ml-1的对照品溶液。

2.2.3 芦丁对照品溶液的配制精密称取芦丁对照品1.74 mg置20 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，既得浓度为86.96 μm·ml-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 连翘苷供试品溶液的配制精密称取0.5 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15 ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理25 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5 g拌匀，加在中性氧化铝柱(100～120目，1 g，内径为1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，既得。

2.3.2 连翘酯苷供试品溶液的配制精密称取0.05 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇150 ml，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足缺失的重量，摇匀，滤过，取续滤液既得。

2.3.3 芦丁供试品溶液的配制精密称取0.5 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足缺失的重量，摇匀，滤过，取续滤液既得。

2.4 标准曲线的绘制精密移取上述对照品溶液适量，加甲醇稀释为1、2、3、4、5、6号标准品溶液，分别含连翘苷、连翘酯苷和芦丁的梯度浓度。对照品溶液分别进样10 μl，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，做线性回归。连翘苷的回归方程为:y=5.9769x+7.7299，r= 1.0000，线性范围为10.25～327.92 μg·ml-1；连翘酯苷的回归方程为:y=9.4900x+3.9411，r=0.9994，线性范围为4.08～130.63 μg·ml-1；芦丁的回归方程为:y=17.8510x-12.1370，r=0.9999，线性范围为2.72～86.96 μg·ml-1。见表1。

表1 各标准品溶液中物质浓度 (μg·ml-1)

2.5 精密度试验分别精密吸取连翘苷、连翘酯苷、芦丁对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定峰面积，结果显示连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD分别为：1.01%、0.44%、0.89%，说明该方法精密度良好。

2.6 重复性试验取同一连翘药材(批号20171001)粉末6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μl，依2.1法测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD值分别为：1.69%、1.14%、0.71%。说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μm，按照2.1法分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD值分别为：0.88%，0.70%，0.72%。说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验取已知含量的连翘粉末，加入一定量对照品，按供试品制备方法制备样品，测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁含量，计算回收率，6次测得的平均回收率，连翘苷为98.73%，RSD为2.6%；连翘酯苷为99.77%，RSD为1.84%；芦丁为98.26%，RSD为2.26%。见表2～表4。

表2 连翘苷加样回收试验

表3 连翘酯苷加样回收试验

表4 芦丁加样回收试验

3 含量测定

3.1 不同温度相同时间炒连翘主要有效成分含量变化取同一批次连翘500 g各5份，用测温枪确定炒锅温度，分别用110 ℃、130 ℃、150 ℃、170 ℃、190 ℃火力快速翻炒12 min，冷却，记录失重，粉碎，过5号筛。依前法处理，测得发现当温度升高到170 ℃，3种有效成分均开始下降，见图1。

图1 不同温度相同时间炒连翘有效成分含量变化

3.2 相同温度不同时间炒连翘主要有效成分含量变化取同一批次连翘500 g各5份，用测温枪确定炒锅温度150 ℃，快速翻炒6 min、9 min、12 min、15 min、18 min，冷却，记录失重，粉碎，过5号筛。依前法处理，测见随炒制时间延长，连翘苷、芦丁变化不明显，连翘酯苷含量自15 min时快速下降，见图2。

图2 不同时间相同温度炒连翘有效成分含量变化

据此确定2因素3水平正交试验的条件，温度：130 ℃、150 ℃、170 ℃，时间：9 min、12 min、15 min。

3.3 正交试验取同一批次连翘500 g各9份，如下述条件炒制样品9份，冷却，记录失重，粉碎，过5号筛。依前法处理，结果见表5。

3.4 重复试验将上述结果进行统计分析，发现炮制温度对连翘有效成分的影响大于炮制时间，炒连翘适宜炮制条件为150 ℃，炒制9～12 min，继续进行3批次重复验证，选取150 ℃，12 min为炮制条件，按前法处理连翘样品，结果见表6。

表6 不同批次生炒连翘有效成分含量对比

注：t检验结果显示：连翘苷、芦丁相比P<0.05，差异具有统计学意义。

4 讨论

炒连翘为山西上党地区沿用多年的地方经验用药，属我院临方炮制品种，我市名老中医张跃英认为，生连翘过于苦寒，久服耗伤人体正气，炒制连翘去性存用，更适合慢病久病之人，她常用炒连翘治疗慢性胃炎、胰腺炎、胆囊炎等病，证见湿重于热者，且中病即止，不可久服。

本试验旨在观察连翘炮制前后连翘苷、连翘酯苷、芦丁的含量变化，为炒连翘提供试验依据。

实验结果表明，炒制连翘，提升了连翘苷的含量，降低了芦丁的含量，而连翘酯苷含量变化不明显，这可能是因为炒制提高了连翘苷的溶出率，而芦丁属于受热不稳定成分，随温度升高，含量逐渐降低。

炒制温度与炒制时间相比，炒制温度对连翘的有效成分含量影响更大，随着炒制温度升高，3种有效成分含量均迅速下降，说明炒制连翘需控制好温度。我们既往经验是中火炒制到连翘充分爆壳，这与试验观察基本吻合：150 ℃火力，翻炒9～12 min至连翘充分爆壳开裂为度。

中药有效成分非常复杂，以上试验，仅为炒连翘物质基础的一个初探，今后，我们还会从其他试验角度，继续对比生、炒连翘的物质变化，以期逐步揭示炒连翘的物质基础。