纳米蒙脱石对奶牛日粮中黄曲霉毒素B1的吸附效果研究

尚佳琪，周东年，王雅晶，刘 潇，李胜利，卢 娜

（中国农业大学动物科技学院，北京市生鲜乳质量安全工程技术研究中心，北京海淀100193）

黄曲霉毒素（AFs），主要是由曲霉属中的黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）代谢产生的一类化学结构、致毒基团和理化性质相似的毒性极强的次生代谢产物。目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有20余种，主要是黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2以及由 B1和 B2经过羟化作用而衍生成的代谢产物黄曲霉毒素M1和M2，且M1和M2主要存在于牛奶中 。这些常见的AFs中，毒性及致癌性最强的是AFB1，然后依次是AFM1、AFG1、AFB2和 AFG2。 其中，AFB1和 AFM1在1993年和2002年分别被世界卫生组织癌症研究机构划分为I类致癌物（齐琪，2012；Bickers等，1994）。

霉菌毒素的污染问题日趋严重，若检查处理措施不当，会造成严重的经济损失以及食品安全等问题。当奶牛食入污染AFB1的饲料时，会引起免疫系统失调紊乱，导致肝脏和肾脏的脂肪酸沉积，引发脑病和水肿病，以及真胃变位、子宫炎、乳房炎等疾病的发生。此外，AFB1会抑制蛋白质的合成，使血清蛋白浓度发生变化，严重影响奶牛的体况和生产性能（黄禄华等，2013；陈波，2013；程广龙等，2012；张治淮等，2012）。在霉菌毒素的防治上，预防是最简单廉价的措施，需严格把握饲料原料的储存和运输过程中的环境条件以及对水分的控制。除预防之外，霉菌毒素吸附剂的使用也很有必要。霉菌吸附剂具有体外吸附和体内抑制霉菌毒素的能力，是目前最常用的脱毒法。本试验选取一种纳米蒙脱石吸附剂，通过与黄曲霉毒素B1同时添加在奶牛日粮中，旨在研究纳米蒙脱石吸附剂的吸附效果，降低毒素在牛奶中的残留。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验所用纳米蒙脱石吸附剂购自浙江某公司，产品为灰白色粉末。纳米蒙脱石具有特殊的晶层结构，由于各晶层间的静电不平衡使得层面具有电负性，对体积较小的黄曲霉毒素具有很大吸附力。

试验所用黄曲霉毒素B1标准品购自广州宝柏贸易有限公司，品牌为Enzo Life Sciences，产品纯度高达98%以上。

1.2 试验设计与饲养管理 选取产奶量 [（36.2±3.5）kg]、胎次[（1.8±0.5）胎]和泌乳天数[（140±15）d]相近的健康荷斯坦泌乳牛45头，按每组15个重复随机分为3组，每个重复1头牛。对照组饲喂基础日粮，试验Ⅰ组在基础日粮中添加0.1 mg/kg的黄曲霉毒素标准品，试验Ⅱ组在基础日粮中添加0.1 mg/kg的黄曲霉毒素标准品+3 g/kg的纳米蒙脱石吸附剂 （于每日晨饲时在基础日粮中添加样品，搅拌均匀）。试验在中国农业大学顺义基地进行，试验牛在同一牛舍散栏饲养，每日分3次饲喂全混合日粮（TMR）（8：00、14：00、20：00），并保证5%的剩料量，自由饮水，每日于挤奶厅挤奶3次（7：00、13：00、19：00）。 试验期间使用动物采食监控系统（AIMS）监控奶牛采食量。预试期7 d，正试期 14 d，共 21 d。

1.3 试验日粮 试验期间以牧场TMR为基础日粮，日粮参照NRC（2001）配制。三组日粮除样品添加不同，其他原料组成完全相同。基础日粮组成和营养水平见表1。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 饲料样品的采集与营养成分的测定 试验期间每7 d采集一次基础日粮和剩料，采集样品用四分法进行收集，将所收集样品置于65℃烘箱烘干48 h，回潮48 h后制成风干样，粉碎后保存待测。根据张丽英（2016）所述方法对常规营养成分进行分析。

表1 试验日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.4.2 干物质采食量的测定 试验期间利用AIMS系统记录每日采食量与剩料量，计算干物质采食量（DMI）。

1.4.3 产奶量、乳成分及牛奶中黄曲霉毒素M1的测定 试验期间每天记录每头奶牛的产奶量。于正试期第0天、第7天、第14天按早中晚4∶3∶3混合均匀共100 mL采集奶样，所得奶样其中50 mL加入重铬酸钾防腐剂及时送至北京奶牛中心做乳成分测定，测定指标包括：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、体细胞数和乳固形物的含量。其余50 mL送至北京莱博泰瑞科技发展公司测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量。

1.4.4 血液指标的测定 于正试期第0天、第7天、第14天每组随机挑选5头牛，于晨饲前用真空采血管进行尾根采血10 mL。所采集血液置于4000 r/min离心机，10 min后，将所得血清分装在1.5 mL离心管中-20℃保存待测。血样送至北京莱博泰瑞科技发展公司测定，测定指标包括：谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOP）、碱性磷酸酶（ALP）和黄曲霉毒素B1的含量。

1.4.5 黄曲霉毒素转化率

转化率/%=牛奶中黄曲霉毒素M1检出量/日粮中黄曲霉毒素B1添加量×100。

1.5 数据分析 试验数据先使用Excel 2007进行初步整理，之后采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏多重比较法进行差异显著性检验，显著水平定为P＜0.05，结果以“平均值±标准差”表示。

表2 添加AFB1和吸附剂对奶牛生产性能和牛奶中AFM1含量的影响

2 结果与分析

2.1 DMI、产奶量、乳成分和牛奶中黄曲霉毒素M1含量 如表2所示，试验Ⅰ组的产奶量分别较对照组和试验Ⅱ组降低0.64 kg/d和0.50 kg/d（P＜0.05）；试验Ⅰ组的4%校正乳分别较对照组和试验Ⅱ组降低1.01 kg/d和0.65 kg/d （P＜0.05）；试验Ⅰ组牛奶中黄曲霉毒素M1分别较对照组和试验Ⅱ组提高 1.57 μg/L 和 1.44 μg/L（P ＜ 0.05），试验Ⅱ组稍高于对照组，但无显著差异（P＞0.05）；三组之间DMI和各项乳成分均无显著差异。

2.2 血清中酶活性和黄曲霉毒素B1含量 如表3所示，霉菌毒素的添加会很明显的影响血清中相关酶的活性和AFB1的含量。除GPT活性在三组间无显著差异外（P＞0.05），试验Ⅰ组的GOT和ALP活性以及AFB1的含量分别较对照组和试验Ⅱ组显著提高了 8.86、5.31、1.23 U/L （P ＜0.05），8.64、4.25、1.20 U/L（P ＜ 0.05），其中，对照组和试验Ⅱ组的各项指标均未产生显著性差异（P ＞ 0.05）。

表3 添加AFB1和吸附剂对奶牛血清酶活性和AFB1含量的影响U/L

3 讨论

3.1 DMI、产奶量、乳成分和牛奶中黄曲霉毒素M1含量 大量研究表明，奶牛日粮在被黄曲霉毒素污染时，会直接影响奶牛的生产性能。国内外对于黄曲霉毒素和吸附剂应用的研究较多。Kutz等（2009）在泌乳中期奶牛日粮中添加黄曲霉毒素B1和吸附剂后发现，奶牛的产奶量、干物质采食量以及乳成分都没有发生显著性的变化。Queiroz等（2012）在受到黄曲霉毒素污染的日粮中添加了不同剂量的吸附剂后得出结论，吸附剂的使用并没有改变奶牛干物质采食量和产奶量。熊江林（2014）发现，不同添加水平的吸附剂并没有显著改善采食被污染日粮的奶牛生产性能。齐琪（2012）在研究中发现，黄曲霉毒素B1对奶牛日粮的污染并没有影响到奶牛的产奶量和乳脂、乳蛋白，但乳糖含量却显著上升。本研究中，吸附剂的使用对奶牛的干物质采食量和乳成分没有产生影响，但是显著提高了奶牛的产奶量和4%校正乳产量。各研究得出结论不同的原因可能与黄曲霉毒素B1和吸附剂的添加量水平不同、吸附剂种类不同以及日粮组成差异等有关。

黄曲霉毒素在奶牛机体中代谢迅速，奶牛在采食被黄曲霉毒素B1污染的日粮后，黄曲霉毒素M115 min后就会出现在血液中，12 h后就会出现在牛奶中，24 h后可达到最大浓度 （Moschini等，2010）。当停止采食被污染日粮72 h后，牛奶中不再会检测出黄曲霉毒素 M1（Masoero等，2007）。经过研究发现，日粮中的黄曲霉毒素B1转化为牛奶中的黄曲霉毒素M1存在线性规律，其转化率为0.1%~6%（Coffey 等，2009），马美蓉等（2014）表明，转化率的平均理论值为1.7%。Kutz等（2009）在研究中得出，转化率为1.42%~2.65%。本试验中，黄曲霉毒素B1添加水平为100 μg/kg，牛奶中黄曲霉素M1检出量为1.62 μg/L，转化率为1.62%，与前人研究结果相似。在我国乳及乳制品黄曲霉毒素M1限量标准中规定，鲜奶中黄曲霉毒素M1的限量标准为 0.5 μg/kg（梁江等，2013），本试验通过吸附剂的使用，使牛奶中的黄曲霉毒素M1从1.62 μg/L下降至 0.18 μg/L，低于国家标准限制（0.5 μg/L），说明此吸附剂对毒素吸附效果良好。

3.2 血清中酶活性和黄曲霉毒素B1含量 黄曲霉毒素B1对动物体肝脏危害最大，毒素在肝脏蓄积后容易引起肝癌。ALP、GOP和GPT三种酶是评估肝脏功能是否正常的重要指标，这三种酶的活性会由肝细胞的破损而增加。齐琪（2012）表明，日粮中添加20 μg/kg和40 μg/kg的黄曲霉毒素B1对反映肝脏功能的酶活性无显著影响。熊江林（2014）在奶牛日粮中添加20 μg/kg黄曲霉毒素B1后得出相似结论。Helferich等（1986）在肉牛的日粮中添加600 μg/kg的黄曲霉毒素B1，结果显示，无论是在饲喂毒素期间还是观察期间，均观察到肝脏的病变现象。在本试验中，黄曲霉毒素B1的添加量为100 μg/kg，试验结果显示，GOT和ALP酶活性显著上升，说明黄曲霉毒素B1会影响奶牛的肝脏功能。但是与前人研究结果相比，对反映肝脏功能的酶活性的影响却不同。推测导致结果不同的原因可能是黄曲霉毒素B1的添加量不同，但是具体能影响到酶活性的添加量水平需要进一步考证。

黄曲霉毒素B1不仅会影响到动物的生产性能，毒素还会沉积在动物的肝脏、肾脏、血液以及肌肉中，影响机体健康。本试验中，随着黄曲霉毒素B1的添加，血清中黄曲霉毒素B1含量显著上升，但是通过添加吸附剂后，毒素水平可降低至正常水平，进一步肯定了吸附剂对毒素的吸附作用。

4 结论

4.1 日粮中添加0.1 mg/kg黄曲霉毒素B1，奶牛的产奶量和4%校正乳显著下降，牛奶中黄曲霉毒素M1含量显著上升，血清中GOP和ALP活性显著增强以及血清中黄曲霉毒素B1含量显著上升。

4.2 在黄曲霉毒素B1污染的日粮中添加3 g/kg的纳米蒙脱石吸附剂可有效缓解奶牛产奶量下降、有效吸附黄曲霉毒素B1，牛奶中黄曲霉毒素M1的含量符合国家最高限量标准。