高效液相色谱测定棉酚方法的建立及不同棉酚脱毒方法比较

亓秀晔， 谢全喜， 刘乃芝， 于佳民，赵 倩， 张志焱， 徐海燕， 谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂省级重点实验室，山东泰安271000）

棉籽饼（粕）作为一种高蛋白含量的植物蛋白原料，营养价值远比谷类蛋白质高，近似豆类蛋白质，是一种极具开发潜力的植物蛋白质饲料资源。然而，棉籽粕中含有棉酚、环丙稀脂肪酸、单宁等有毒物质，制约了其在畜牧业中的应用，其中最主要的是棉酚。棉酚主要分为游离棉酚和结合棉酚，结合棉酚是指能与氨基酸、磷脂和小肽等化合物结合的棉酚，化学键不易被打破，在机体消化系统中不被吸收，可很快随粪便排出体外，毒性很低；游离棉酚分子结构中的活性基团（醛基和羟基）对动物毒性很大，长期饲喂动物过多的未经脱毒的棉籽粕饲料，棉酚会在动物体内蓄积，引发中毒，损害雄性动物生殖系统发育，严重可导致动物出现急性呼吸窘迫临床症状，厌食乏力，甚至死亡等（亓秀晔等，2018；刘建成等，2012；朱德伟等，2010）。

目前，检测游离棉酚的方法有分光光度计法（侯敏等，2016；朱德伟等，2010）、薄层层析法（沈静等，2011；袁久荣等，2000）、高效液相色谱（HPLC）法（阮栋等，2014；何晓文等，2013；沈媛等，2012）等。分光光度法选择性不强，与游离棉酚有相似化学结构的物质均能被同时检出，使得检测结果偏高，并且操作繁琐，使用的苯胺等溶剂具有毒性；薄层层析法也具有样品分离度低、准确度低、溶剂毒性较强、操作繁琐等不足；HPLC法则具有分离效率高、灵敏度高、准确性高、简便快速、可自动化检测等优点，具有广泛的应用前景。

不同的脱毒方法对棉籽粕的脱毒效果不同，目前常用的脱毒方法分为物理法、化学法、微生物法等，每种方法都各有优缺点。本研究旨在建立快速、准确的测定棉籽粕游离棉酚的 HPLC方法，并采用不同的脱毒方式对棉籽粕中的游离棉酚进行降解，以筛选合适的脱毒法以达到更好的脱毒效果，为棉籽粕的合理开发和利用提供理论基础和试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵原材料及菌株 试验用棉籽粕由山东磁窑农场提供，粉碎过40目筛。

酵母菌（Yeast）菌株：产朊假丝酵母BLCC4-0327由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院菌种保藏中心保存。本项目组前期试验已证实该株菌具有降解棉酚效果。

1.1.2 培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖 （YEPD）培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.1.3 化学试剂 葡萄糖，山东祥瑞药业有限公司；磷酸、氯化钠，天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氢钾，天津市致远化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。乙腈、丙酮、甲醇（均为色谱级），天津市永大化学试剂有限公司；微孔滤膜 （直径13 mm、孔径 0.22 μm），上海安谱有限公司；棉酚标准品[高效液相色谱（HPLC级）]，上海源叶生物科技有限公司。蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母膏，天津市英博生化试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 棉籽粕原料 不经过任何处理。

1.2.2 高压高温脱毒 将棉籽粕经过121℃高压灭菌1 h后，常温冷却。

1.2.3 硫酸亚铁法 准确称取500 g棉籽粕，按棉籽粕游离棉酚含量 5倍添加硫酸亚铁（棉籽粕游离棉酚含量为1300 mg/kg），将硫酸亚铁溶解于2500 mL水中，搅拌均匀，将500 g棉籽粕浸泡于溶液中，3 h后捞出沥干，放置于40℃烘箱烘4 h（敖维平等，2015）。

1.2.4 尿素脱毒处理方法 称取6.5 g尿素溶解于 400 mL水中，混匀后，喷洒在 1 kg棉籽粕粉上拌匀，压实后密封放置7 d（斯热吉古丽·阿山，2016）。

1.2.5 微生物发酵脱毒 酵母菌种子液的制备：将4℃条件下保存的酵母菌BLCC4-0327斜面活化，转接到装有50 mL YEPD培养基的三角瓶中，30℃摇床振荡培养16 h备用。

称取一定量的棉籽粕于1000 mL三角瓶中，料水比为 1.0∶0.4（g:mL)，装料量为 100 g/瓶，按 2%接种量分别接入培养好的酵母菌种子液中，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料为空白对照，均置于30℃培养箱进行需氧发酵48 h。

1.3 游离棉酚含量的测定 棉酚标准溶液的配制：准确称取棉酚标准品，用乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶解得1.17 mg/mL的标准品贮备液，标准贮备液再用乙腈 -0.2%磷酸（体积比为85∶15）稀释成117 μg/mL的标准品工作液 （陈来等，2012）。用流动相将标准品工作液逐级稀释得到浓度分别为 78.48、39.24、13.08、5.232、1.308 μg/mL的标准工作液，浓度由低至高进行测定，以峰面积和浓度作图，得到标准曲线回归方程，为：Y=（5.57655e-006）X+（0.325615），R2=0.99999， 线性范围为 1.308~117 μg/mL。

待测样品游离棉酚的提取：准确称取待测样品 3.00 g，加入丙酮 30 mL，超声提取 30 min，25 ℃下3000 r/min离心10 min，重复提取3次，合并上清液。全部转移至蒸发瓶中，旋转蒸发至干，用乙腈-0.2%磷酸（体积比为85∶15）溶液溶解，多次超声清洗转移至25 mL容量瓶，定容，过0.22 μm滤膜后供高效液相色谱（HPLC）测定。棉酚含量计算公式如下：

棉酚含量/（μg/g）=c×25 mL/m；

式中：c为棉酚溶液的质量浓度，μg/mL；m为样品质量，g。

高效液相色谱（HPLC）法测定棉酚含量：色谱条件为色谱柱Intertsil RODS-2（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸（体积比为85:15）溶液，流速1.0 mL/min，紫外检测波长 235 nm，进样量 20 μL，柱温25℃。

1.4 数据分析 试验数据用Excel 2007进行初步处理后，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）程序进行方差分析，LSD法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 棉酚标准曲线的绘制 由棉酚标准品的HPLC色谱图（图1~图5）可以看出，在9.432 min左右出棉酚色谱峰，且稳定性良好、分离效果好、峰型理想、灵敏度高。由棉籽粕原样的棉酚色谱图（图6）可知，棉籽粕原样的游离棉酚含量为1300.31 μg/g。由图7可以看出，棉酚标准曲线线性吻合良好、定量范围广、定量限低、准确度和灵敏度高，该方法可用于准确测定游离棉酚的含量。

图1 棉酚标准品（1.308 μg/mL）的HPLC色谱图

图2棉酚标准品（5.232 μg/mL）的 HPLC 色谱图

图3 棉酚标准品（13.08 μg/mL）的HPLC色谱图

图4棉酚标准品（39.24 μg/mL）的 HPLC 色谱图

图5棉酚标准品（78.48 μg/mL）的 HPLC 色谱图

图6棉籽粕原料的HPLC色谱图

图7游离棉酚的标准曲线

2.2 棉酚脱毒效果比较 由表1可知，不同脱毒处理方法效果不同，棉酚脱毒率大小排序为：微生物法>硫酸亚铁法>尿素法>高温高压法。最优的方法为微生物法，酵母菌发酵48 h后的发酵棉籽粕棉酚降解率高达93.86%；化学法（硫酸亚铁法和尿素法）脱毒率为53.64%~78.18%，物理法（高温高压）脱毒率最低，为41.00%。

表1 不同脱毒方法比较

3 讨论

3.1 物理法对棉籽粕脱毒效果 物理法主要包括热处理法、溶剂浸提法、挤压膨化法等（李贤永等，2008）。热处理法是对棉籽粕进行加热处理，使棉籽粕中的游离棉酚与蛋白质相络合，由此达到脱去棉籽粕中游离棉酚的目的。本试验中，121℃高压灭菌1 h棉酚脱毒率仅有41.00%，可能与处理时间短有关。热处理方法所处理过的棉籽粕中的蛋白质容易发生美拉德反应，赖氨酸和游离棉酚结合，导致蛋白质利用率降低，同时加热将会耗费大量能源，成本过高。

3.2 化学法对棉籽粕脱毒效果 化学脱毒法是指在棉籽粕中加入某种化学添加剂进行化学处理，在一定条件下破坏游离，或使其成为结合棉酚而失去毒性，达到脱毒的目的。有毒性的游离棉酚具有3种互变异构体，通常情况下呈相对稳定的双醛式。FeSO4中的 Fe2+能与双醛式游离棉酚反应生成变性棉酚-铁络合物，使游离棉酚的活性羟基失去作用而达到脱毒的目的。此棉酚-铁络合物不能被吸收，最终排出体外，不会对动物体产生不良的负作用。因此FeSO4既可以作为棉酚的解毒剂，也能够使棉酚在肝脏中的蓄积量下降，从而预防动物棉酚中毒（王薇薇等，2016）。本试验采用硫酸亚铁对棉籽粕的脱毒率为78.17%，试验结果与李延云等 （1999）的研究结果 （脱毒率60%～85%）相一致。虽然硫酸亚铁脱毒法科学实用，但也存在着铁离子能与棉籽粕中有效的赖氨酸等物质结合，而降低其营养价值的问题，适口性也受到影响，而且硫酸亚铁脱毒后棉籽粕颜色发黑并带有较浓的铁锈味，因此，不宜作为脱毒剂对棉籽粕脱毒。

尿素是主要的酞氨化合物之一，在一定湿度、温度下棉籽粕中游离棉酚能与酞氨类化合物生成西佛碱类加成物，经脱水后生成西佛碱，使游离态棉酚转变为无毒的结合态棉酚，达到脱毒目的。采用该法处理棉籽粕不仅可以达到脱除棉酚的目的，而且能改善适口性，弥补了硫酸亚铁处理后适口性不好的问题 （石秀侠等，2005；张苏红等，2005）。但是本试验采用尿素处理棉籽粕后，棉酚脱毒率较低，只有53.64%，试验结果与王倩等（2015）的报道一致。此外，尿素处理成本比较高。3.3 微生物脱毒 微生物发酵法是目前普遍认为成本低、效果好、较安全的脱毒方法（Dai等，2015； Sun 等，2012；Yang等，2012）。 生物发酵的脱毒主要途径是微生物可分泌降解棉酚类物质的酶类，分解、利用游离棉酚，从而降低游离棉酚的含量；发酵时，一些游离棉酚可与微生物分泌的氨基酸，或与活性蛋白质中游离氨基结合而形成无毒的结合棉酚；固体发酵培养基经灭菌处理，在高温、高压过程中，一部分游离棉酚的结构会被破坏掉，也会使部分游离棉酚和蛋白质中游离氨基结合，形成无毒的结合棉酚（张煜等，2018）。

酵母菌的脱毒作用主要表现在两个方面：酵母菌对真菌毒素、细菌内毒素及其他有害有毒物质具有减毒或脱毒作用；酵母菌细胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白可参与生物脱毒过程 （胡晓清等，2017）。本试验中，酵母菌发酵棉籽粕后降解棉酚效果最好，达到93.86%。

4 结论

4.1 本试验建立的HPLC法测定棉籽粕中棉酚含量，棉酚色谱峰出峰稳定性良好、分离效果好、峰型理想、灵敏度高，可以高效的检测棉酚含量。

4.2 不同处理方法对棉籽粕脱毒效果不同，棉酚脱毒率大小排序为：微生物法>硫酸亚铁法>尿素法>高温高压法。最优的方法为微生物法，酵母菌发酵48 h后的发酵棉籽粕棉酚降解率高达93.86%；化学法（硫酸亚铁法和尿素法）脱毒率为53.64%~78.18%，物理法（高温高压）脱毒率最低，为41.00%。