云南4种罕见异常血红蛋白突变型分析*

2019-04-26何建萍郭薇霞罗胜军吕梦欣党峰博林克勤杨昭庆

国际检验医学杂志 2019年8期

何建萍，郭薇霞，唐健，罗胜军，吕梦欣，党峰博，林克勤，杨昭庆△

(1.昆明市妇幼保健院遗传室,云南昆明 650031；2.中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所遗传室,云南昆明 650118)

血红蛋白病是由于珠蛋白基因突变导致血红蛋白结构或合成量异常的最常见的遗传病，包括异常血红蛋白病和地中海贫血两大类[1]。该病分布广泛，全世界约有7%的人群携带血红蛋白病基因[2]。目前人类血红蛋白变异体数据库HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)收录的血红蛋白突变已经超过了1 300多种,我国报道的已经超过80余种。早期我国大范围血红蛋白病调查结果都显示我国异常血红蛋白分布以云南发生率最高，达到了6.06%和5.9%[3-4]。目前云南异常血红蛋白报道较多的是以产生异常条带E为主的β珠蛋白基因突变HbE(G>A)[5]。本研究通过对7例毛细管电泳检出的罕见异常血红蛋白条带(F、K、J、D)进行分析，确定其突变的基因分子基础，初步探讨罕见基因型与表型的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料获取到云南省昆明市妇幼保健院进行地中海贫血产前筛查时血红蛋白毛细管电泳检出异常血红蛋白条带的女性7例。

1.2方法

1.2.1血液学检查取乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝静脉血2 mL，采用日本sysmex XT-2000i血细胞分析仪检测各项血常规指标。血红蛋白电泳采用欧洲helena V8全自动毛细管电泳仪进行检测。

1.2.2常见地中海贫血突变基因检测采用PCR-反向点杂交法检测23种中国人常见的地中海贫血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用试剂为亚能生物技术(深圳)有限公司提供的地中海贫血基因检测试剂盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段扩增采用QIAGEN公司提供的全血试剂盒，严格按照说明书进行操作，提取DNA样本进行PCR，扩增包含启动子序列及3个外显子在内的α、β珠蛋白基因序列。引物序列参照文献[6]，PCR扩增采用TaKaRa LA Taq高保真酶，仪器采用美国ABI公司的9700PCR扩增仪。HBA1、HBA2、HBB基因PCR扩增体系均为30 μL:每一反应体系含2×Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量约100 ng。反应条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35个循环，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段测序纯化PCR产物后，使用ABI3700测序仪进行测序。

2 结果

2.1血常规检测结果 7例样本血常规参数均为正细胞正色素，无明显异常。见表1。

表1 4种罕见异常血红蛋白突变型血液学参数特征

2.2血红蛋白电泳结果 7例标本共检出4种异常血红蛋白电泳条带：分别为F、K、J、D带，占总血红蛋白的含量范围从38.32%到61.37%。其中代表性的含量异常升高的F带见图1。

图1 Hb San Bruno电泳结果图(Hb F含量升高)

2.3基因型检测结果 α和β珠蛋白序列分析检出4种异常血红蛋白突变型：1例F带为Hb San Bruno(HBB:c.120G>C)、2例K带为Hb New York(HBB:c.341T>A)、2例J带为Hb J-Bangkok(HBB:c.170G>A)、2例D带为Hb G-Coushatta(HBB:c.68A>C)。7例异常血红蛋白均未检出α、β地中海贫血基因突变。见图2。

图2 Hb San Bruno测序结果图(β珠蛋白基因CD39CAG->CAC杂合突变) ，箭头示突变

3 讨论

我国异常血红蛋白分布和发生率具有明显的遗传多态性，在我国南方如广东、广西地区已报道过Hb Q-Tailand、Hb New York、Hb G-Chinese等多种突变种类[6]。本研究对来本院进行地中海贫血筛查时血红蛋白电泳检出异常条带的7例女性样本进行了回顾性分析，通过基因检测确诊了4种血红蛋白的罕见突变，进一步丰富了云南的异常血红蛋白突变谱。

本研究检出了1例Hb San Bruno罕见突变。它是β珠蛋白第39位密码子谷氨酰胺(CAG)突变为组氨酸(CAC)的杂合突变，该突变能产生相对稳定的血红蛋白。这一突变于2002年HOYER在非洲裔美国女性中首次发现[7]，此后未见相关报道,这是第二例报道，也是我国首次发现该突变，提示该突变在不同种族之间都有分布。本次检出的这一例Hb San Bruno除了产生占总血红蛋白含量39%的异常F带，其他血液学参数无明显异常，这与美国报道的携带者呈小细胞低色素贫血不相符，但是美国的携带者呈小细胞低色素贫血是由于该携带者合并了子宫肌瘤造成的。研究进一步支持了该突变不会产生临床表现这一结论。本研究还检出了2例Hb New York和2例Hb J-Bangkok，分别产生异常K带与J带，这与广西和广东报道的我国南方常见异常血红蛋白种类和特点相符[8-9]。此外，本研究检出了2例Hb G-Coushatta，ZHANG等[10]2017年的时候在566例云南β珠蛋白突变携带者中也曾检出1例，而既往报道显示Hb G-Coushatta分布以北方人群为主[4]，但近年来，在广东[11]和江苏无锡[12]等南方地区都有检出，提示Hb G-Coushatta在南方人群中也有分布。

本研究检出的Hb San Bruno、Hb New York、Hb J-Bangkok和HbG-Coushatta血红蛋白电泳分别产生异常的F带、K带、J带和D带，其他血液学参数均无明显异常。这是由于大多数异常血红蛋白是由于血红蛋白分子外部氨基酸发生替代突变，这类替代绝大多数不影响血红蛋白分子的稳定性和功能，因此突变携带者通常无临床表现[13]。尽管本研究检出的四种罕见突变都不产生临床表现，但是云南作为异常血红蛋白发生率最高的地区，曾报道过罕见的血红蛋白突变型Hb Rush(HBB:c.304G>C)[14]，该突变会产生不稳定的血红蛋白，能导致溶血性贫血的临床症状，因此在血红蛋白电泳筛查出异常条带后，有必要对异常血红蛋白病进行基因检测确诊。另一方面，云南是除广州、广西外的地中海贫血高发地区，α地中海贫血发病率3.18%～9.46%，β地中海贫血发病率1.6%～3.56%[15]，因此这些罕见突变有较高的概率合并地中海贫血，有可能产生更严重的血液学表型。有研究报道其他罕见突变类型Hb Gran Via、Hb Macarena和Hb EI Retiro合并α地中海贫血会产生血红蛋白H病，导致中到重度的溶血性贫血[16]。因此，在云南这样容易产生异常血红蛋白和地中海贫血双重杂合子的地区，当血红蛋白毛细管电泳检出异常条带时，有必要对异常血红蛋白突变进行基因检测，积累数据明确其临床表型和危害性，从而更好地指导遗传咨询。

由于异常血红蛋白病绝大多数无临床表现，因此往往不能引起人们的重视。但是这些异常血红蛋白的存在会对糖化血红蛋白(HbA1c)检测结果造成干扰[17]。HbA1c是评价糖尿病患者长期血糖控制水平及糖尿病并发症的重要指标，研究表明利用高效液相色谱法检测时，Hb J-Bangkok会使HbA1c水平假性降低[18]，而Hb New York会使HbA1c水平假性升高[19]，此时检测出的HbA1c不能反映患者近2～3个月的血糖控制水平。因此，在像云南这样异常血红蛋白发生率高的地区，在应用HbA1c评估糖尿病患者血糖控制状况时，应先了解患者的血红蛋白情况，排除因血红蛋白变异体存在而导致HbA1c临床应用风险。