CDKN2A单核苷酸基因多态性与妊娠糖尿病伴HBV感染的临床相关研究

余水泉

(重庆市涪陵中心医院医学检验科，重庆 408000)

妊娠糖尿病(GDM)是指孕妇在怀孕前没有糖尿病，怀孕中或生产后才发现的糖尿病。近年来，GDM在孕妇中的比例呈上升趋势[1-3]，其危害众多，尤其是对病毒性肝炎孕妇，不但影响胎儿在母体内的正常发育、增加母体和新生儿多种并发症的发生，还会增加母体再次妊娠时糖尿病复发率。因此，探究GDM的发病机制，进行早期诊断，对干预治疗降低GDM对母婴的危害具有重要意义。国内外研究表明，病毒性肝炎会增加孕妇患妊娠糖尿病的风险[4]，另一方面，细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)基因多态性与妊娠期糖尿病也有一定的相关性[5-6]，病毒性肝炎、CDKN2A基因多态性与妊娠糖尿病相关性如何，临床研究报道较少。本研究以本院收治的健康孕妇、乙型肝炎孕妇为研究对象，采用飞行时间质谱检测CDKN2A基因的多态性，分析探讨乙型病毒性肝炎、CDKN2A基因多态性与妊娠糖尿病的相关性，为临床提供一定参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年9月至2017年5月本院收治的携带慢性乙型肝炎病毒(HBV)的孕妇240例和未感染孕妇260例。纳入标准如下：(1)携带慢性HBV：血清中HBsAg和HBV DNA呈阳性，肝功能正常的孕妇；(2)GDM：所有妊娠24～32周行75 g口服葡萄糖耐量实验(OGTT)检测：空腹血糖>5.3 mmol/L,餐后1 h血糖>10.0 mmol/L,餐后2 h血糖>8.5 mmol/L，达到上述三项之一者,可诊断GDM。若上述节点血糖水平均小于临界值，则诊断为正常糖耐量(NGT)。排除标准：(1)孕期合并其他感染，如妊娠高血压患者，感染单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、HIV等。(2)患有脂肪肝、肝硬化或肝癌等影响正常肝功能的孕妇。(3)孕前应用糖皮质激素类药物、细胞毒性药物等。(4)胎儿发育异常或多胎孕妇。根据参与孕妇是否含有HBV，将所有孕妇分为两组：携带慢性HBV的孕妇240例(A组)，未感染HBV孕妇280例(U组)作为对照组。然后根据孕妇是否为GDM，将A组患者分为A1(HBV携带的GDM孕妇)和A2(HBV携带的非GDM孕妇)，U组患者分为U1(无携带的GDM孕妇)和U2(无携带的非GDM孕妇)。所有对象在知情同意下，签署知情同意书，两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.2方法 两组孕妇空腹12 h后，口服75 g葡萄糖1 h，2 h，3 h后检测各孕妇的血糖含量和各组孕妇的糖化血红蛋白(HbA1c)水平。根据OGTT的GDM诊断标准，分析比较两组患者的GDM发病率。提取、保存各患者的DNA，采用飞行时间质谱测所有孕妇的基因型(送至重庆医科大学进行检测)，具体步骤如下：首先PCR扩增目的基因序列，将患者DNA与芯片基质共结晶后放入质谱仪的真空管；然后用强激光激发使基质晶体升华，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子，在真空小管中飞行到达检测器，最后检测出各基因分型。分析孕妇CDKN2A基因rs10811661的三种基因型TT,TC,CC的分布及等位基因T和C的分布频率。

表1 两组孕妇一般资料的比较

2 结 果

2.1两组患者妊娠糖尿病发病率比较 A组患者的GDM发病率与U组患者相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2两组患者基因型分布的哈代-温伯格定律检验结果 本研究提供500例患者，TT基因型181例，TC基因型183例，CC基因型136例，根据Hardy-Weinberg平衡定律公式：

[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)

p=(181×2+183)/1 000=0.545

q=(136×2+183)/1 000=0.455

计算H-W期望数=N(p2AA 2pqAa q2aa)，最后P>0.05，无显著性差异。因此，本研究入选患者的基因型分布符合哈代-温伯格定律。

2.3两组患者的基因型分析及等位基因分布频率比较 A组中，A1组孕妇182例，A2组孕妇58例；U组中，U1组孕妇60例，U2组孕妇200例。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三种基因型的分布在A1与A2中,差异具有统计学意义(P<0.05),U1与U2组之间差异不明显(P>0.05)。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三种基因型的分布在A1组与U1组有显著差异(P<0.05)；A1组危险基因T的分布频率高于U1组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 两组患者妊娠糖尿病发病率比较[n(%)]

注：和U1组相比，aP<0.05

3 讨 论

糖尿病是由各种致病因子作用于机体导致胰岛素供应不足或胰岛素在靶细胞不能发挥正常生理作用下，使体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢发生紊乱的临床综合征。GDM对母婴的主要危害是增加了胎儿在宫内发育异常、新生儿窒息、畸形等不良结局的发生[7-8]。因此，GDM的早发现、早诊断、早治疗具有重要意义。目前，GDM的具体发病机制尚不明确，但有研究报道，病毒性肝炎孕妇GDM发病率高于健康孕妇群体。肝脏是参与糖代谢的重要器官，感染HBV后，病毒繁殖激发机体正常的免疫系统，发生自身免疫，导致肝脏功能异常，进而会影响正常的糖代谢，甚至导致糖尿病的发生[9-10]。此外，还有研究显示，位于9号染色体上的CDKN2A，抑制CDK4和CDK6的活性，CDK4的过表达又影响胰岛B细胞的功能，使其受损从而减少胰岛素的分泌，和Ⅱ型糖尿病的发生有关。在病毒性肝炎中，肝细胞CDKN2A的过表达和肝进行性纤维化、肝癌及胆囊癌的发生、发展有着密切的关系[11-15]。

本研究通过收集并比较本院收治的乙型病毒性肝炎孕妇及健康孕妇的GDM发病率发现，HBV感染孕妇GDM发病率为75.8%，而健康孕妇的GDM发病率为23.1%，HBV感染孕妇的GDM发病率显著增加(P<0.05)。这一结果说明，HBV侵袭破坏肝脏细胞，使得孕妇肝功能异常肝脏受损，从而影响肝脏中的糖代谢过程，恶性循环最终会导致机体糖代谢发生紊乱。由于孕妇处于特殊时期，机体代谢负担加重，一旦出现糖代谢紊乱很可能增加GDM的发病率。同时，本研究还将感染HBV携带GDM的孕妇与感染HBV的NGT孕妇进行了CDKN2A基因rs10811661分布多态性的比较，发现两组患者CDKN2A基因的三种TT、TC、CC基因型分布明显不同，感染HBV携带GDM的孕妇TT显著增高(P<0.05)。未感染HBV患有GDM的孕妇与未感染HBV的NGT孕妇相比，CDKN2A基因rs10811661的三种基因型的分布差异无统计学意义(P>0.05)。但是感染HBV的GDM孕妇中与未感染HBV的GDM孕妇中有显著差异，CDKN2A基因rs10811661的危险基因T的分布率也明显不同。上述结果表明HBV感染、CDKN2A基因rs10811661 T/C多态性和GDM的发病具有相关性。机制可能是患有乙型病毒性肝炎，同时携带危险等位基因T的孕妇的胰岛B细胞更易受损。但由于GDM是一种由遗传、环境与生活习惯等因素共同引起的疾病，又因本研究样本数量有限，故有待于进行大样本、多基因、多因素的联合分析。

本研究首次探究了HBV携带GDM孕妇和无HBV感染GDM孕妇的CDKN2A基因多态性分布情况。发现HBV携带GDM孕妇CDKN2A基因分布和HBV无GDM孕妇差异有统计学意义(P<0.05),等位基因T出现的频率明显增加。与此同时，与健康GDM孕妇相比，HBV携带GDM孕妇危险基因T的分布频率显著上升(P<0.05)，证实病毒性肝炎和CDKN2A基因rs10811661T/C多态性是GDM的发病有一定的相关性，是其发病的重要影响因素。